《过程分子生物学》PPT课件.ppt

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1、过程分子生物学,5,2,3,4,1,6,基因的表达与调控,细胞通讯的分子机制,免疫多样性的分子识别,胚胎发育的基因表达谱,肿瘤发生的分子机制,基因组学与系统生物学,基因组学与系统生物学,E,B,C,D,A,F,基因组与基因组学,基因组图谱的制作,基因组文库的构建,基因组序列的测定,基因组结构的解析,系统生物学的内涵,6A 基因组与基因组学,二十世纪人类科技史上产生了三大划时代创举：40年代第一颗原子弹爆炸、50年代人类首次登上月球、90年代人类基因组计划实施。后者以10年光阴、30亿美元的代价，测定了人类全套遗传物质30亿对碱基的排列顺序。DNA双螺旋结构的发现者、美国国家卫生研究院（NIH）

2、的博士1990年在Science上撰文指出，与阿波罗登月计划相比，虽然人类基因组计划的资金投入少，但它对人类生活的影响却可能更深远。事实正是如此，人类基因组计划实施的二十几年来，生命科学的研究与应用发生了翻天覆地的变化，以基因组学,为核心的各种组学学科应运而生。,6A 基因组与基因组学,基因组学是研究生物体基因组结构和功能的学科。其中：,a 基因组与基因组学的基本概念,基因组学（Genomics）,对基因组物理结构进行测序和分析的研究，称为结构基因组学；,整体水平上阐明各基因生物功能的研究，称为功能基因组学，又称,为后基因组学。,基因组（Genome）,一种生物全部基因（包括染色体、细胞器中所

3、含的全套遗传物质）的集合称为该生物的基因组。,6A 基因组与基因组学 b 基因组学的学科体系,研究物种,研究层次,环境,表观,比较,功能,结构,病毒,细菌,真菌,植物,动物,人类,药物,营养,毒理,神经,疾病,研究因子,化学,进化,寄生于人体内的细菌种群：宏基因组学,未改变基因组序列但显示功能改变,6A 基因组与基因组学,c 基因组学的主要研究方式,基因组学的主要研究方式是启动并实施各种生物的基因组计划。基因组计划的主要工作任务是绘制各种图谱。,遗传图谱,物理图谱,序列图谱,基因图谱,转录图谱,表达图谱,功能图谱,进化图谱,基因组学,蛋白质组学,转录组学,代谢组学,各种生物体蛋白质的时空特异性

4、表达谱制作；,各种生物体蛋白质的结构与构象分析；,各种生物体蛋白质之间的相互作用谱制作。,各种生物体蛋白质的结构与功能的关系研究；,蛋白质组学（proteomics）的研究内容,基于酵母双杂交技术的蛋白质之间相互作用探测程序 Y2H,转录启动,DB,AD,DB,AD,基因应答元件,启动子,报告基因,诱饵蛋白,筛查蛋白,基因文库,基于蛋白片段互补技术的蛋白质之间相互作用探测程序 PCA,酵母MAT-a单倍体细胞,酵母MAT-a单倍体细胞,a,a,交配,氨甲喋呤平板,氨甲喋呤平板,二氢叶酸还原酶F1-2片段,二氢叶酸还原酶F3片段,诱饵蛋白,筛查蛋白,a-a,a-a,蛋白质之间相互作用图谱的制作与

5、分析,酵母芽颈生长过程,酵母自我吞噬过程,基于免疫共沉淀技术的蛋白质-DNA相互作用探测程序 ChIP,转录调控因子,组蛋白,细胞核内,破碎细胞,DNAase处理,转录调控因子特异性抗体,免疫共沉淀,释放,克隆,测序,筛查到98个p53的新结合位点,6A 基因组与基因组学,d 基因组学的研究进展,截止到2004年9月，已有205种生物的基因组完成测序，其中包括：真核生物19种；原核生物167种；古细菌19种。另外，还有更多种类的生物体已完成基因组草图甚至部分测序，如：牛、羊、猪、狗、猫、鸡、青蛙、海胆、蜜蜂、疟蚊、蕃茄、苜蓿、燕麦、大麦、小麦、玉米、高梁、大豆等，微生物更是不不计其数。,截止到

6、2006年底，基因组完成测序的生物累计已达1600余种。,从2010年起，国际上又启动了千人基因组计划。,截止到2010年底，基因组完成测序的生物累计已达近5000种。,6A 基因组与基因组学,e 人类基因组的基本特征,人类基因组的大小,噬菌体,大肠杆菌,酵母,拟南芥,线虫,果蝇,水稻,老鼠,人类,玉米,小麦,百合,阿米巴虫,2.0 x 105 bp,6.0 x 1011 bp,4.2 x 106 bp,1.0 x 107 bp,1.5 x 107 bp,1.0 x 108 bp,1.7 x 108 bp,4.3 x 108 bp,3.0 x 109 bp,3.3 x 109 bp,5.4 x

7、 109 bp,1.6 x 1010 bp,5.0 x 1010 bp,6A 基因组与基因组学,e 人类基因组的基本特征,人类基因组的结构,人类基因组中含有大量的重复顺序和高度重复顺序，非重复顺序只占总基因组的大约54-58%。例如，tRNA和rRNA编码基因在人染色体,DNA上的拷贝数分别为：,18S/28S rRNA编码基因,5S rRNA编码基因,tRNA编码基因,280,2000,1300,6A 基因组与基因组学,e 人类基因组的基本特征,人类基因组的性质,人体基因总数约为 2.5 万个95%以上的基因含有内含子结构每个基因的平均外显子数为 7 个基因的平均长度为 16.3 kbmRN

8、A的平均长度为 2.2 kb,6B 基因组图谱的制作,基因组的遗传和物理图谱的制作有助于基因组的克隆与测序，它可以帮助人们将全套基因组以路标的形式分割成小片段，进行基因克隆、测序和鉴定，即所谓的 top-down 战略；如果将基因组DNA随机打断成片段，全部测序后，依据序列重叠性重新拼在一起，完成整条,染色体上的DNA排列顺序，这就是所谓的 bottom-up 战略。,基因组图谱主要有四种，即遗传图谱、物理图谱、功能图谱、转录图谱。遗传图谱是染色体的定性路标，而物理图谱则是定量路标。,6B 基因组图谱的制作,a 遗传图谱与物理图谱的基本概念,遗传图谱又称连锁图谱，是指基因或DNA标记在染色体上

9、的相对位置与遗传距离，后者通常以基因或DNA标记在染色体重组交换过程中的分离频率厘摩（cM）表示。cM值越大，两者之间距离越远。遗传图谱制作时所涉及基因或DNA标记越多，越密集，所得到的遗传图,谱的分辨率也就越高。,基因组的遗传图谱,6B 基因组图谱的制作,a 遗传图谱与物理图谱的基本概念,物理图谱是指基因或DNA标记在染色体上的实际排列顺序位置，通常以已知核苷酸序列的DNA片段（如：序列标签位点，sequence-tagged site，STS；或限制性内切酶识别位点）为“路标”，以碱基对,（bp、kb、Mb）作为基本测量单位（图距），对基因组进行作图。,基因组的物理图谱,6B 基因组图谱的

10、制作,生物体内的DNA和染色体普遍存在着同源重组现象。同源重组的频率首先取决于两条染色体或DNA双链的同源性程度；在相同的同源性情况下，重组频率又取决于两遗传位点（或基因之间的）距离，相,b 利用遗传重组法绘制遗传图谱,距越远重组频率越高。,就人体而言，在授精卵细胞中共有23对染色体，每对染色体的一条来自精细胞，另一条来自卵细胞。每对中的两条染色体互为同源染色体，相对应的基因称为等位基因。同源染色体在授精之后胚胎发育,之前，会发生同源重组。,遗传同源重组机制,Aa、Gg等互为等位基因，如果它们两两之间不是100%同源，那么经同源重组后，g等就不再与a等同存（连锁）于一条染色体上，它们将出现于不

11、同的子代个体中，并表现出不同的性状，即孟德尔遗传规律。根据两个性状在第,A B C D E F G H I J,a b c d e f g h i j,A B C D E f g h i j,a b c d e F G H I J,重组,A B C D E F G H I J,a b c d e f g h i j,A B C D E f g h i j,a b c d e F G H I J,分离交配,分离交配,三代中的分离连锁频率，即可知道其重组频率。重组频率愈高的两个性状，其基因位点在原来亲本染色体上的距离也就越远。通过多对性状的比较，即可测定其基因位点的前后相对排列顺序。上世纪初，摩尔

12、根和他的研究生就是用这种方法研究果蝇的遗,传图谱的，到1915年，他们在果蝇染色体上已排定了85个遗传位点的顺序。,6B 基因组图谱的制作,人细胞与啮齿类动物细胞通过细胞融合技术可形成杂合细胞。在这种杂合细胞中，人染色体会随着杂合细胞的增殖分裂而逐渐丢失，并可分离到含有单一人染色体的杂合细胞。该细胞本质上是鼠的，含有正常的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因（HPRT）。这个基因的产物催化次黄嘌呤合成次黄嘌呤单核苷酸（IMP），IMP可在细胞内转化,c 利用照射杂交法绘制遗传图谱,成AMP和GMP。,照射杂交法操作程序,含单一人染色体的杂合细胞用X射线照射，所有染色体均被打断成8 Mb长的小片段，杂合细

13、胞被杀死。然后将之与HPRT-的中国仓鼠细胞融合，融合细胞一般只含有两三个染色体碎片，不同的融合细胞含有不同的人染色体片段。最后再用一组人的DNA探针杂交融合细胞的染色体DNA片段。哪一对标记探针在同一融合细胞中同时呈杂交阳性的出现频率越大，它们彼此就靠得越近，反之亦然。这样，即可排出这,这些标记的前后排列顺序。人的第18号染色体就是用此法制作了40Mb的遗传图谱。,X-射线照射,细胞融合,探针杂交,人鼠杂合细胞,HPRT缺陷型中国仓鼠细胞,仓鼠融合细胞,人染色体探针,6B 基因组图谱的制作,限制性片段长度多态性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymor

14、phism）技术特别适用于突变基因在染色体上的定位。其工作原理如下：基因突变会导致分子病尤其是遗传病的发生。这些突变包括核苷酸碱基点突变、缺失、插入，它们很可能在导致基因突变的同时，也使得限制性内切酶切位点发生变化，从而改变限制性内切酶酶解片段的长度。因而通过正常人与病人染色体酶切片段长度的对比,d 利用RFLP法绘制遗传图谱,分析，便可找到突变基因，并将之定位于染色体的某一片段上。,RFLP的工作原理,相同区条带：正常人与病人均存在的带谱，反映人种基因组的相似性 离散区条带：正常人与病人均不相同的带谱，反映人个体基因组的差异性 病变区条带：正常人与病人分别具有相同的特征带谱，但两者之间的,相

15、同区,A B C D E F G H I,离散区,相同区,病变区,带谱显著不同，病变基因就位于这些条带上,正常人,病人,DNA琼脂糖凝胶电泳图谱,杜兴肌营养不良症的病理,杜兴肌营养不良（Duchenne Muscular Dystrophy）症是因为患者的DMD基因突变造成的，该基因编码Dystrophin蛋白。DMD病变基因的突变位点正好处于DNA上BglII的酶切位点内（AGATCTAGGTCT），从而使得病人的该BglII位点消失，形成一个30kb的BglII片段，而正常人则为8kb和22kb两个BglII限制性片段,6B 基因组图谱的制作,高等真核生物的染色体DNA上存在着大量的重复序

16、列，如长度在15-65bp范围内的小卫星DNA、长度在2-6bp范围内的微卫星DNA，后者又称为简短串联重复序列（SSR）。以SSR两侧的已知序列为引物，PCR扩增这一SSR序列，经测序便可鉴定该SSR的长度及重复单位数。通过对多个SSR序列的遗传连锁分析，即可测定这些SSR标记在染色体上的相对位置。1996年，利用上述原理绘制出的人类染色体完整连,e 利用PCR扩增法绘制遗传图谱,锁图谱，相邻标记间的平均距离仅0.7厘摩。,SSR1,SSR2,SSR3,SSR4,SSR5,6B 基因组图谱的制作,PFGE：Pulsed Field Gel Electrophoresis，即脉冲场凝胶电泳。遗

17、传图谱是在染色体DNA上标注基因或遗传位点相对位置；而物理图谱则是标注限制性内切酶位点或已知DNA片,f 利用PFGE法绘制物理图谱,N,S,W,E,段的实际位置。,特大型DNA片段的制备,将细胞包埋在低温灌注的凝胶中；凝胶块用蛋白酶K、RNA酶（不含DNAase）处理，DNA在被固定后基本上不因剪切力而断裂；然后整个凝胶块用哺乳动物DNA上稀有的限制性内切酶消化，如NotI（GC/GGGCCGC）、Sfi I（GGCCNNNN/NGGCC）等。经这两种酶分别,酶切后，染色体DNA断裂成几百甚至几千kb的大片段。,特大型DNA片段的分离,采用PFGE技术可将200至3,000 kb的DNA片段

18、分开。消化后的凝胶块直接放入PFGE普通凝胶孔内，上千kb的DNA片段通常需要连续走,几天电泳才能分开。,随机探针原位杂交,人的第21号染色体的三种限制性酶切图谱就是采用这一技术制作的。,部分酶解,全酶解,1700 kb,1400 kb,1200 kb,1000 kb,700 kb,200 kb,S1探针杂交,S2探针杂交,S3探针杂交,1700,1400,700,1200,1000,200,6B 基因组图谱的制作,g 利用DNA克隆片段的重叠性绘制物理图谱,如果某一生物体的染色体DNA已被全部克隆，便可以借助于下列三种实验程序，确定每个克隆中的DNA片段的排列顺序，由此构成以,酶切片段末端标

19、记法,克隆编号为标记的基因组物理图谱。,随机探针联合杂交法,染色体走读排序法,C159,C094,C436,C512,C298,C777,酶切片段末端标记法,H,H,H,H,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,单一克隆指纹图谱,十克隆指纹图谱,载体DNA,克隆DNA,将若干克隆固定在薄膜上，并复制20份薄膜；合成20种不同序列的短探针，其序列是随机的；用20种探针随机定位杂交（一对一）20份克隆薄膜；如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将阳性记为“1”，而阴性记为“0”，,随机探针联合杂交法,这样便可将结果清

20、晰地列成一张表，最终排出上述克隆的排列顺序。,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,A B C,D E F,G,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,01,04,12,06,13,14,02,14,07,19,11,15,05,08,16,03,10,09,20,18,D,A,B,C,E

21、,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,F,C,A,D,G,E,B,染色体走读排序法,从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列,分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库，阳性克,分别亚克隆，亚克隆片段在0.5-2.0 kb范围内。,然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至,隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起。,线型染色体DNA的端点。,走读的起点克隆片段,染色体走读排序法,走读的起点克隆片段,亚克隆旁测序列,探针标记,第一轮杂交,阳性

22、克隆,阳性克隆,第二轮杂交,第二轮杂交,6C 基因组文库的构建,原核生物的基因文库大都采用l-DNA或Cosmid载体构建，但若用Cosmid构建人的基因组文库，工作量太大，几乎难以进行。目前已发展了用酵母人造染色体（YAC）或细菌人造染色体（BAC）克隆几百甚至上千kbDNA大片段的技术，这样可大大简化构建人基因组文库的工作量。例如，要求人基因组文库的完备性为99.999%，若用Cosmid（装载量为40kb）构建一条人染色体的基因组文库（平均长度为150Mb），则需要4.3104个克隆；而用YAC载体构建则,仅需4.3103个克隆，相当于将整条染色体DNA克隆10-15次。,6C 基因组文

23、库的构建,a 用于大型基因组文库构建的克隆载体,开发装载量在100-1000kb范围内的克隆载体是基因组计划实施的,酵母人造染色体（YAC）,重要条件。目前已发展了多种用于克隆大型DNA片段的特殊载体：,细菌人造染色体（BAC）,噬菌体人造染色体（PAC）,可转化人工染色体（TAC）,人类人工染色体（HAC）,6C 基因组文库的构建,a 用于大型基因组文库构建的克隆载体,酵母人造染色体（YAC）,细菌人造染色体（BAC）,噬菌体人造染色体（PAC）,可转化人工染色体（TAC）,人类人工染色体（HAC）,用于构建大型基因组文库的克隆载体的性能,人造染色体类型,载体名称,复制子类型,最大装载量,p

24、BeloBAC11,大肠杆菌F性因子,酵母自主复制序列,2000 kb,pYAC4,P1噬菌体DNA复制子,300 kb,150 kb,pYLTAC17,P1和Ri质粒复制子,100 kb,pCYPAC1,人染色体DNA复制子,6000 kb,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的复制子,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制起始位点,酵母染色体的中心粒序列,酵母系统的选择标记,大肠杆菌的复制子,大肠杆菌的选择标记,YAC载体的一般装载量为350-400 kb，最高可达2000 kb。,酵母人造染色体载体p

25、YAC4,酵母染色体的端粒序列,6C 基因组文库的构建,b 单一染色体的分离纯化,细胞培养物用有丝分裂抑制剂乙酰甲基秋水仙碱处理；有丝分裂停止了的细胞松散地贴在培养皿的底面上，稍稍抖动，即可将之收集到试管中；将细胞悬浮在染色体分离缓冲液中处理，以维持染色体结构，同时灭活细胞内核酸酶；染色体用DNA特异性染料染色，AT富含区由,Hchst 33258染色，GC富集区为色霉素A染色。,染了色的染色体在合适波长下会发出荧光，Hchst染料的发光波长为351和363nm；色霉素A染料的发光波长为458nm。染了色的染色体由于DNA碱基排顺列序的差异而显示出不同的染料量比例和染色区域，,从而构成每条染色

26、体的特征性荧光谱。,染色体的染色,荧光激活细胞分类仪,当染色体溶液进入荧光激活细胞分类仪（FACS）后，在两种波长激光的照射下发出荧光，光电倍增管将光信号转换为电信号，并在染色体溶液中通电使染色体带电。然后通过电场收集单一染色体，并由电脑识别之。由于人的第9-12号染色体之间的差别不大，因此用FACS难以将之分开。,收集细胞,低渗裂解细胞,进柱分离,紫外激光发生器,可见激光发生器,6C 基因组文库的构建,c 从单一染色体上分离纯化DNA片段,利用超精细玻璃针在光学显微镜下将染了色的染色体各区带切开，并挑出染色体碎片；将染色体片段用蛋白酶消化，苯酚提取，乙醇沉淀，即可用于基因的定位克隆。从20条

27、单一的人染色体上大约能获得0.3pg（0.310-12 g）的DNA，这在克隆实验中已足够。,6C 基因组文库的构建,d YAC基因组文库的构建程序,单一染色体DNA用EcoRI部分酶解，PFGE电泳分离，切下350-400kb的条带，提纯DNA片段，或者密度梯度离心，除去300kb以,下的DNA片段；,pYAC载体用 EcoRI/BamHI 联合酶解，分离出长短臂；,将DNA大片段与载体的两个臂相连；,重组DNA分子电击转化酿酒酵母菌球形体；,利用筛选标记筛选重组子，重组YAC具有与天然酵母染色体相似,的性质，复制一次并进行有丝分裂。,YAC克隆DNA片段的程序,按上述程序获得大片段的基因组

28、文库之后，再利用DNA克隆片段的重叠性，以酶切片段末端标记法、随机探针联合杂交法、或染色体走读排序法绘制物理图谱。,6D 基因组序列的测定,DNA测序技术自Sanger于1977年发明的双脱氧末端终止法以来，先后经历了凝胶电泳测序、毛细管电泳测序、高通量平行测序三大技术革新。30多年前基于Sanger双脱氧末端终止法的手工测序能应付细菌基因组的分析，但已无法直接满足人类基因组测序的要求。一个训练有素的DNA测序员最快一天只能测定1kb的DNA片段，为了使误测率减小至最低程度，每个DNA片段两个方向至少共需测四次，即1kb的DNA片段一人需花四天时间才能完成！这还不包括模板克隆所花的时间，而后者

29、花费的时间通常比测序更多。因此，必须发展新一代的DNA高速测序方法。目前实验室成熟或正在发展的DNA高速廉价测序方法包括：,a 基于双脱氧末端终止法的全自动测序战略,Klenow,OH 3,5 P,T,dNTP+ddATP,T,T,T,T,T,OH 3,5 P,传统的Sanger双脱氧末端终止法程序,聚丙烯酰胺,凝胶电泳,DNA聚合测序反应,克隆待测DNA片段,阅读序列,TACGACTCAGGATTGAC.,改进的全自动测序战略采用同样测序原理，但在进行四个DNA聚合反应时使用标记四种不同荧光基团的测序引物，这使得四个聚合反应物可混合在一起进行毛细管电泳分离，并可利用仪器自动识别阅读，从而大幅

30、度提高测序的速度和精度。一台全自动测序仪每小,改进的全自动测序战略,时可测7kb，出错率仅为10-4。,6D 基因组序列的测定,b 基于DNA合成的单核苷酸加入测序战略,2005年底，美国454生命科学公司的Jonathan Rothberg及其同事推出了全新的基于DNA合成的超高通量测序系统，这套价格50万美元的系统连续阅读长度为330bp，可在8小时内完成450Mb的DNA测序工,（1）待测DNA样品（模板）的预处理,作！整个测序流程由下列四个环节组成：,（2）待测DNA样品（模板）的PCR扩增,（3）DNA测序反应,（4）数据处理与分析,6D 基因组序列的测定,b 基于DNA合成的单核苷

31、酸加入测序战略,待测DNA样品（模板）的预处理,A 接头,B 接头,高压气流随机打断,400-600 bp片段,两端连接扩增和测序接头,6D 基因组序列的测定,b 基于DNA合成的单核苷酸加入测序战略,待测DNA样品的固相乳胶PCR扩增（emPCR）,变性,包裹,水油乳胶微泡,释放,随机打断,微型磁珠,6D 基因组序列的测定,b 基于DNA合成的单核苷酸加入测序战略,多重DNA测序反应,3 T-C-G-A-G-G-G-A-C-C-A-G-T-C-G-T-A-,5 A-G-C-T-C-C-G,pppT,PPi+APS,sulfurylase,ATP,luciferase,luciferin,ox

32、y-luciferin+hv,皮升板160万孔,6D 基因组序列的测定,c 基于DNA合成的循环可逆终止测序战略,待测DNA样品的固相桥式PCR扩增,双向引物均交联在载玻片上,6D 基因组序列的测定,c 基于DNA合成的循环可逆终止测序战略,DNA的循环可逆终止的合成,3-阻断型的可逆终止核苷酸；四色荧光基团；核苷酸掺入后，洗去未反应的游离核苷酸，检测荧光信号，随后再利用特殊试剂分别除去信号基团和阻断基团，恢复3-OH。,信号基团,阻断基团,6D 基因组序列的测定,c 基于DNA合成的循环可逆终止测序战略,DNA的循环可逆终止的合成,3-非阻断型的可逆终止核苷酸；四色荧光基团；,6D 基因组序

33、列的测定,d 基因芯片测序法,基因芯片是固定在玻璃、纸张、尼龙等固体平面上的寡聚核苷酸点阵（DNA Array，Genechip）。合成一定长度（12-24bp）的寡聚核苷酸全排列探针，分别固定在已知位置的芯片上。待测序DNA样品经处理（如超声波），形成一定长度的片段，标记荧光基团；然后与上述全排列芯片进行杂交；杂交后的芯片清洗条件控制在只允许与DNA样品100%配对的探针存在与芯片上；最后送入阅读仪检测，电脑识别,杂交阳性荧光斑点，并根据芯片探针序列排列DNA的碱基顺序。,基因芯片测序原理,A,T,C,G,A,A,G,C,A,T,G,T,T,C,G,A,A,G,C,A,T,G,T,C,T,C

34、,G,A,G,C,A,T,G,T,C,A,T,C,A,G,C,A,T,G,T,C,A,C,G,C,A,G,C,A,T,G,T,C,A,C,G,C,G,C,A,T,G,T,C,A,C,G,G,G,C,A,T,G,T,C,A,C,G,T,G,C,A,T,G,T,C,A,C,G,T,C,G,A,T,G,T,C,A,C,G,T,C,A,G,T,G,T,C,A,C,G,T,C,A,C,G,G,T,C,A,C,G,T,C,A,C,T,G,T,C,A,C,G,T,C,A,C,T,T,T,A,G,C,T,T,C,G,T,A,C,A,A,A,G,G,T,G,C,C,A,G,T,G,A,A,C,荧光标记基团,待测

35、DNA样品,探针,基因芯片,基因芯片目前还无法用于测序，原因是点阵的集成度远远达不到要求。对于高等哺乳动物基因组的测序而言，芯片上的探针长度至少应在24个碱基，这样探针的全排列总数高达 3X1014（424）！而目前基因芯片能达到的最大集成度,芯片测序法的限制,只有1X109。,6D 基因组序列的测定,遵循信息科学界的“摩尔定理”,十年间测序成本降低十万倍,6E 基因组结构的解析,基因组DNA序列分析全部完成之后，人们即获得了基因组的序,确定基因的位置，绘制基因图谱（结构基因组学）；,列图谱。接下来的任务便是：,确定基因转录的时空特异性，绘制转录图谱和表达图谱；,确定基因的功能，绘制功能图谱（

36、功能基因组学）。,6E 基因组结构的解析,a 在染色体DNA上定位基因,人染色体DNA上的基因（尤其是蛋白质编码基因）排列得非常松散，以每个基因平均长度16kb、共22.5万个基因计算，基因区不足DNA总长的10%，且其中只有14%的DNA序列是基因编码区，而其它部分均为内含子结构。因而，即便获得了基因组DNA的序列，要想知道各基因的准确位置，也不是件容易的事。目前，已建立了多种有效,测蛋白质编码基因的外显子边界的方法。,动物园杂交法（Zoo blot）,由于进化的原因，人体内绝大部分的蛋白质结构基因在其它哺乳类动物体内均存在，且具有高度的同源性。因而，在靶基因区域内任取若干DNA小片段为探针

37、，杂交各种动物的DNA基因组。凡是在许多动物基因组上均有阳性反应的DNA探针片段，便极有可能是外显子，而内含子序列在动物种属之间通常是无同源性的。一旦一个基因的外,显子全部找到，整个基因的左右边界便可确定。,GC岛探测法,人类基因转录单位的上游，存在着GC丰富区，这一区域的DNA片段可用那些识别序列中富含GC的内切酶消化，能切开的地方很有可,能是基因的上游邻近区。例如：,Apa I（GGGCCC）,Nar I（GGCGCC）,Xma III（CGGCCG）,Sma I（CCCGGG）,Sst II（CCGCGG）,BssH II（GCGCGC）,外显子扩增法,将克隆的DNA片段插入到某一基因的

38、两个外显子之间，并接在哺乳动物载体上，转化动物细胞。从中分离纯化mRNA，逆转录成单链DNA，PCR扩增，电泳比较cDNA片段大小。若克隆的DNA片段含有外显子，则cDNA,E1,E2,Intron,待测片段,重组,转录,剪切,反转录,DNA,hnRNA,mRNA,cDNA,应比两个外显子更长。,cDNA杂交对比定位法,以生物体特定组织或细胞的cDNA芯片杂交克隆的基因组DNA片段，杂交阳性的DNA克隆序列即,为蛋白质编码基因。,6E 基因组结构的解析,b 确定基因的时空特异性表达谱,生物体,肝脏,大脑,血液,神经,心脏,红细胞,噬中粒,噬酸粒,噬碱粒,血小板,G0 期,G1 期,G2 期,S

39、 期,M 期,基因组定位,cDNA文库,6E 基因组结构的解析,c 确定基因的生物功能,基因定点敲除 gene knock-out,基因定向导入 gene knock-in,Loss-of-Function,Gain-of-Function,6F 系统生物学的内涵,a 系统生物学的研究内容,系统生物学是从系统水平上了解生命本质，利用综合性的原理、方法、技术研究分子行为与系统特性之间的对应关系，进而借助于计,算生物学工具定量阐明和预测生物的功能、表型、行为。,系统生物学将孤立的基因和蛋白质水平上的各种相互作用、各种代谢途径、信号转导途径等方面的信息整合起来，用以表征生物整体,的性状和过程，因此系

40、统生物学是生命科学中的大科学。,6F 系统生物学的内涵,b 系统生物学的研究策略,细胞,组织,个体,物理因子,化学因子,生物因子,扰动,检测,基因组,转录组,蛋白组,代谢组,调控组,6F 系统生物学的内涵,c 基于转录机器扰动的系统生物学研究案例,原核生物的s因子识别启动子,转录启动,TATA-BOX,TBP,TAFs,真核生物的 TFIID 复合物识别启动子,全转录机器工程 Global transcription machinery engineering gTME,Alper Stephanopoulos：Metabolic Engineering.9.258.2007,大肠杆菌s70因

41、子的编码基因 rpoD,rpoD 基因突变文库,大肠杆菌s70因子突变株,导入,s70因子变体,内源性s70因子,易错PCR,扰动,乙醇耐受性突变株的筛选,Alper Stephanopoulos：Metabolic Engineering.9.258.2007,红色：突变株,蓝色：对照株,突变株与对照株的系统生物学比较,利用基因芯片定量分析对照株和突变株分别在乙醇存在和不存在时的基因转录谱。,分子伴侣,休克蛋白,膜压力感应,药物响应,外膜蛋白F,琥珀酸脱氢酶,氮源代谢,阿洛糖结合蛋白,磷酸核糖异构酶,超氧化岐化酶,小调控型RNA,顺戊头酸酶,核糖体小亚基,铁蛋白,外膜蛋白W,对照株,突变株,考试时间：公元 2013 年 1 月 17 日 周四 下午 1:30-3:30,答疑时间：公元 2013 年 1 月 16 日，9:00-23:00,考试地点：八教 207 和 210 室,答疑地点：实验十四楼对面小白宫二楼 导师办公室,试题类型：术语解释（20%）,四重单选（50%）,简述分析（30%）,联系方式：,