《转录组测序原理》PPT课件.ppt

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1、转录组测序技术原理,转录本,All transcripts,All mRNAs,主要内容,样品检测文库制备Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析,Total RNA样品检测,Agilent 2100 检测OD260/280:1.82.2 RNA 28S:18S 1.0;RIN7,检测报告-合格样品,检测报告-不合格样品,主要内容,样品检测文库制备Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析,第一天,消化DNA,mRNA的分离,mRNA的打断,cDNA的合成,第二天,末端修复,加接头,胶回收,3端加A,第三天,PCR,

2、PCR胶回收,文库制备,真核mRNA的纯化,mRNA的纯化主要通过磁珠吸附原理从而分离纯化Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要是mRNA的3的poly A与磁珠在bindingbuffer的作用下相结合。磁珠通过MPC（磁分离器）从溶液中分离出来。mRNA与磁珠结合后，再用Tris-HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中。,原核mRNA的纯化,Ambion MICROExpress Kit,mRNA反转录,纯化过的mRNA样品加入1 l的fragment buffer 70作用1.5min。加入1l的stop buffer终止反应。加入沉淀剂（NaAc 糖原 无水乙醇）沉淀酶切产物。,末端修复c

3、DNA 3末端加AAdapter连接,不同方法比较,主要内容,样品检测文库制备Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析,主要内容,样品检测文库制备Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析,新一代测序技术,Throughput:up to 25 Gb per day,合成第一个碱基,Cycle 1:按顺序加入反应试剂,清除未反应的碱基和试剂,激发碱基荧光并收集荧光信号 去除阻断基团和荧光基团,Cycle 2-n:重复前面的步骤,基于SBS测序技术,碱基片段杂交,Cluster station,剩下的复制链其一端“固定

4、”在芯片上，另外一端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定”住，形成“桥”(bridge)。形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增，形成双链。双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下一轮扩增的模板继续扩增反应。反复若干轮扩增，每个单分子得到了大量扩增，成为单克隆“DNA簇群”。,主要内容,样品检测文库制备Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析,生物信息分析,基本信息分析,数据量产出：2Gb per sample测序策略：HiSeq2000,PE91 or 101插入片段大小：200 bps 测序质量控制：Q20%80,有参考基因组序列生

5、物信息分析,基因结构优化鉴定基因可变剪接预测新转录本SNP 分析基因融合鉴定,有参考基因组序列信息分析流程,Reads 在基因组上的分布,基因结构优化,(Nagalakshmi,U.et al.,2008),通过转录组测序鉴定出酵母3 和5 UTR区域,鉴定基因可变剪接,exon1,exon2,exon3,exon1,exon2,exon3,exon1,exon3,common reads,junction reads,mRNA,鉴定融合基因,新转录本预测,N Eng J Med 2009,SNP分析,Deep RNA sequencing at single base-pair resolu

6、tion reveals high complexity of the rice transcriptome,Genome Res 2010,Rice Transcriptome,Material callus root at seedling stage（14d）shoot at seedling stage（14d）flag leaves（2 stages）panicle（3 stages）Methods RNASeq（paired-end&single end）DGE small RNA（18-30 nt）,基因功能注释基因结构分析鉴定出大量新转录本可变剪接鉴定基因融合鉴定,无参考基因组

7、生物信息分析,Unigene功能注释Unigene的GO分类Unigene代谢通路分析预测编码蛋白框（CDS）Unigene表达差异分析Unigene在样品间的差异GO分类和Pathway富集性分析,De novo reads组装流程,Unigene GO 分类,Unigene COG 功能分类,基因表达差异分析,N1:total tag Number in sample A N2:total tag Number in sample BX:Gene expression level in sample A y:Gene expression level in sample BReference:Audic S.et al.The significance of digital gene expression profiles.Genome Res.1997 7(10):986-995,Unigene pathway 富集性分析,Pathway富集性分析列表,Thank you,