《转录及转录后加工》PPT课件.ppt

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1、第 五 章,转录及转录后加工,生化教研室 肖建英,第一节 转录的基本原理第二节 DNA指导下的RNA聚合酶第三节 与转录起始和终止有关的DNA结构第四节 转录后加工过程及其机制,主要内容：,转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程。,转录,第一节 转录的基本原理,一、基本概念,参与转录的物质,原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶(RNA polymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子,转录与复制的相似之处：都是酶促的核苷酸聚合过程；都以DNA为模板；都需依赖DNA的聚合酶；聚合过程都是核苷酸之间生成磷酸二酯键；都从5至3

2、 方向延伸成新链多聚核苷酸；都遵从碱基配对规律 但转录忠实性要低于DNA复制。转录与复制都受到严格的调控,二、转录与复制的异同,转录和复制的区别,引物 有 无高度进行性 中途不停止 可一段一段复制,一、原核生物的RNA聚合酶,大肠杆菌(E.coli)的RNA聚合酶是由4种亚基、和(sigma)组成的五聚体蛋白质，分子量为480kD。2合称为核心酶(core enzyme)；在试管内能催化NTP聚合生成RNA。亚基加上核心酶(2)称为全酶（holoenzyme)。,第二节 DNA指导下的RNA聚合酶,大肠杆菌RNA聚合酶组分,RNA聚合酶,核心酶(core enzyme),全酶(holoenzy

3、me),RNA聚合酶,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,RNA聚合酶,真核生物的RNA聚合酶,种类,定 位 核 仁 核 质 核 质转录产物 45s-rRNA hnRNA 5s-rRNA,tRNA,U1-13snRNA U6snRNA，（U6除外）非UsnRNA 对鹅膏蕈碱反应 耐受 极敏感 中度敏感,二、真核生物的RNA聚合酶,RNA聚合酶,转录模板,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structural gene)。DNA双链按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作反意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(co

4、ding strand)，也称为有意义链或Crick链。,5G C A G T A C A T G T C33 c g t c a t g t a c a g5,5G C A G U A C A U G U C3,N Ala Val His Val C,DNA,转录,mRNA,翻译,肽,DNA模板、转录产物mRNA 和氨基酸序列之间的关系,编码链,模板链,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,不对称转录(asymmetric transcription),在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；模板链并非永远在同一条单链上。,第三节 与转录起始和终止

5、有关的DNA结构,一、原核生物的启动子和终止子,（一）启动子结构,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。,RNA聚合酶保护法,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognition site),-35区-10区+1trp T T G A C AN17T T A

6、 A C T N7 AtRNAtrp T T T A C AN16 T A T G A T N7 ALac T T T A C AN17T A T G T T N6 ArecA T T G A T AN16T A T A A T N7 Aara C T G A C GN18T A C T G T N6 A最大一致性 T T G A C A T A T A A T 38 36 29 40 25 30 37 37 28 41 29 44,X/45,被RNA聚合酶保护的DNA区段碱基序列分析,1、Pribnow 框：,10区，保守序列为 TATAAT。Pribnow 框是RNA聚合酶的牢固结合位点，

7、简称结合位点。,的存在保证原核生物RNA聚合酶只能与启 动子区而不是其它区域形成稳定的二元复合物。,2、Sextama 框：,35区，保守序列为TTGACA。Sextama 框是RNA聚合酶中 的识别位点，也是RNA聚合酶的初始结合位点。,Pribnow 框与Sextama 框之间的碱基序列 并不重要，但两个序列之间的距离十分重要；天然启动子这段距离多为1520bp，距离的 大小可能是决定启动子强度的因素之一。实验表明：两个序列之间的距离为17bp时，转录效率最高。,3、CAP位点：（乳糖操纵子的启动子序列）,CAP即分解代谢物基因激活蛋白(catabolite gene activation

8、 Protein)也称环腺苷酸受体蛋白（CRP）。,CAP分子内有两个结构域：羧基末端结构域是DNA结合区；氨基末端结构域是cAMP结合位点。CAP与cAMP的结合能提高CAP对双链DNA 的亲和力；CAP与启动子（CAP位点）的结合是激活乳 糖操纵子转录的必要条件。,乳糖启动子中有两个CAP结合位点：一个在 70 50位点，称位点；一个在 50 40位点，称位点。,位点包含一个反向重复序列，是强结合位点；位点是弱结合位点。,（二）终止子结构,提供转录终止信号的序列称为终止子（terminator）。终止信号存在于RNA聚合酶已经转录过的序列之中。,原核生物终止子分为两类：一类是不依赖于因子的

9、转录终止；一类是依赖因子的转录终止；,两类终止子有共同的序列特征：在转录终止点之前有一段间断的回文结构。,两类终止子碱基组成的不同点：不依赖因子 回文结构富含G-C 下游富含A-T 依赖因子 G-C含量较少 下游无特征,转录方向,3,3,5,TCGGGCGAGCCCGC,CGCCCGAGCGGGCT,AAAAAATTT TTT,3,3,5,5,DNA,模板链,编码链,AAAAAAUUUUUU,5,TTTTTT,DNA,模板链,编码链,转录产物,3,不依赖因子 的终止子,转录方向,3,3,5,TAAGTAGATTCATC,CTACTTAGATGAAT,AGCTACTCGATG,3,3,5,5,D

10、NA,模板链,编码链,AGCTACUCGAUG,5,TCGATG,DNA,模板链,编码链,转录产物,3,依赖因子 的终止子,二、真核生物的启动子,类启动子分两部分：40 5 称为近启动子，决定转录起始的位点；16540 称为远启动子，影响转录的频率。,真核生物的三种RNA聚合酶，每一种都有自己的启动子类型。,（一）RNA聚合酶的启动子,即 rRNA 基因的启动子，称类启动子。,（二）RNA聚合酶的启动子,1、帽子位点（cap site）：即转录起始位点，其碱基大多为 A。,2、TATA 框：又称Hogness 框，由含有TATA 的67个核苷酸组成，保守序列为 TATA（A/T）A（A/T）。

11、但TATA框的两侧富含G-C碱基对。,TATA 框位于25 附近，精确决定转录起始位点。其序列的完整与准确对维持启动子的功能是必需的。,即 mRNA基因的启动子，称类启动子,3、CAAT 框：,位于 75 附近，保守序列为 GGNCAATCT。头两个 G 非常重要，一但突变，转录效率大大下降。CAAT 框控制着转录起始的频率。,4、GC 框：,位于110附近，以5 CCGCC 3序列为特征。,5、增强子（enhancer）：,能结合反式作用因子，决定基因的时间和空间特异性表达，增强启动子转录活性的DNA序列。,增强子作用特点：增强效应十分明显：使转录频率增加百倍或千倍。增强效应与其所处的位置和

12、取向无关：增强子以53或 35排列对启动子都有作用。大多为重复序列：长约50bp，适合与反式因子结合，内部常有一个核心序列，为增强效应所必需。增强效应具有严密的组织和细胞特异性。没有基因专一性。许多增强子受外部信号的调控。,真核生物RNApol的启动子,（三）RNA聚合酶 的启动子,即 tRNA基因的启动子，称类启动子。,类启动子位于转录起始点下游，称 下游启动子或内部启动子。,类启动子包括：A盒、B盒 A盒靠近5方向；B盒 靠近3 方向。,类启动子需要的转录因子包括：TF C、TF B、TF A，前两者是共同的，后者为5S rRNA基因转录所需。,三、原核生物和真核生物 转录起始位点的结构差

13、异,图5-4 P155页,原核生物与真核生物启动子比较,原核生物和真核生物转录及抑制剂,第 四 节,原核生物转录的起始 原核生物转录的延长 原核生物转录的终止与新合成RNA链的释放 真核生物的转录 RNA生物合成抑制剂,转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、原核生物转录的起始,4.10区DNA双链解开1217bp，形成开放的二 元启动子复合物（模板酶）。,2.RNA聚合酶全酶(2)与模板35序列结合，形成闭合的二元闭合启动子复合物。,转录起始过程,1.因子辨认转录起始点（-35区的TTGACA序列）,3.RN

14、A聚合酶向10区转移，并与之牢固结合。,5-pppG-OH+NTP 5-pppGpN-OH 3+ppi,5.在RNA聚合酶亚基催化下形成第一个磷酸二酯键，形成三元复合物（模板酶RNA）。,6.当三元复合物中RNA长69个核苷酸时，因子 从全酶解离下来，进入延长阶段。,RNA聚合酶有两个核苷酸结合位点：一个是起始核苷酸位点；一个是延长核苷酸位点。一般只有嘌呤核苷酸填充了起始位点，才能形成第一个磷酸二酯键。,二、原核生物转录的延长,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP)n+NTP(NMP)

15、n+1+PPi,3.碱基配对原则：A-U，T-A，G-C4.延长中的转录复合物也叫转录空泡。随着RNA 聚合酶前移，转录产物RNA不断移出转录空泡，已转录完毕的DNA双链又重新复合而不再打开。5.原核生物的转录和翻译偶联进行。,转录空泡(transcription bubble)：,RNA-pol（核心酶）DNA RNA,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,依赖因子的转录终止非依赖因子的转录终止,三、原核生物转录的终止和新生RNA链的释放,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类,（一）依赖 因子的转

16、录终止,1969年，Roberts发现了能控制转录终止的蛋 白质，即因子。它由相同的6个亚基组成六聚体，分子量200kD。,因子具有NTP酶活性和解螺旋酶活性，是促 使转录三元复合物解离的根本原因。因子的 NTP酶活性依赖于单链RNA的结构。,因子依赖性终止子含有一个反向重复序列，使 RNA末端形成一个发夹结构，导致转录延宕，因子得以发挥作用，终止转录。,（二）非依赖 因子的转录终止,DNA模板接近转录终止的区域内，有较密集 的A-T配对区或G-C配对区，且G-C配对为回 文结构。转录产物RNA的3-末端有若干个连续的U。连续U区的5-端前方碱基形成茎环结构或发 夹结构。这种二级结构是阻止转录

17、继续向下 游推进的关键。,转录方向,3,3,5,TCGGGCGAGCCCGC,CGCCCGAGCGGGCT,AAAAAATTT TTT,3,3,5,5,DNA,模板链,编码链,AAAAAAUUUUUU,5,TTTTTT,DNA,模板链,编码链,转录产物,3,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；密集A-U 配对使转录复合物趋于解离，释放RNA。,四、真核生物的转录,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化。转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，而需依靠众多的转录因子，与模板结合形成转录起始前复合物，其起始过程比原核生物复杂得多。,转录起始点,TATA盒,

18、CAAT盒,GC盒,增强子,转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,TATA box：启动子核心序列，-25bp区段。CAAT 盒GC 盒增强子,转录起始前的上游区段,参与RNA-pol转录的TF,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RN

19、A-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,（三）转录终止,1、RNA聚合酶转录出rRNA前体3末端后，继续向下游转录超过1000个bp时，存在一个 18bp的终止序列。2、RNA聚合酶 转录模板的下游存在一个 终止子，是位于GC丰富序列之中的TTTT。RNA聚合酶有内原性的转录终止功能。3、RNA聚合酶的转录没有明确的终止信号。,原核生物与真核生物转录的区别,原核生物 真核生物,RNA pol 一种 高度分工起始转录因子 没有 需要（各不同）延长核小体影响 没有 有

20、启动子以外序列 没有 有且复杂转录产物 多顺反子 单顺反子场 所 转录与翻译偶联 不偶联 转录终止 两种终止子 不明确,五、RNA生物合成抑制剂,概念：能阻断、抑制或者干扰核酸的代谢 过程，最终抑制转录的一类化合物，称RNA生物合成抑制剂。,分三类：1、嘌呤和嘧啶类似物，抑制核酸前体的合成；2、通过与DNA结合而改变模板的功能；3、与RNA聚合酶结合而影响其活力。,（一）利福霉素及利福平,作用：抗结核药物，特异地抑制细菌RNA聚合酶 的活性，因而抑制细菌RNA的合成。,机制：利福霉素可与RNA聚合酶的亚基结合，并阻止起始位点的填充，抑制二核苷酸 RNA的形成；利福平则阻止RNA聚合酶的移动，抑

21、制 头三个核苷酸的形成。因此，利福霉素和利福平都是RNA链合成 起始过程的抑制剂。,（二）利迪链菌素,作用：与细菌的RNA聚合酶亚基结合，抑制 转录过程中RNA链的延长反应。,转录后加工过程及其机制,第五节,mRNA的前体加工 rRNA的前体加工 tRNA的前体加工 RNA的剪接和RNA催化活性 RNA编辑,真核细胞每种转录产物都是各种RNA的前身，即无活性，亦无功能。真核初级转录产物必须在胞核内经过适当加工，使之变成具有活性的成熟RNA后，由胞核运至胞 质才能执行翻译功能。真核细胞转录作用和翻译作用无论在空间上还 是时间上都是彼此分开进行的。原核细胞mRNA不需加工，tRNA和rRNA加工。

22、,真核细胞与原核细胞转录产物的区别：,一、mRNA的前体加工,1、5端形成 帽子结构(m7GpppNp)2、3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail)3、中部剪接除去内含子4、链内部核苷酸的甲基化,hnRNA转变成mRNA的加工过程包括：,修饰的化学反应：,5-端的修饰在核内完成，且先于中段剪切。,5帽子分Cap0、Cap1、Cap2。,（一）5-端加上帽子结构(mGpppNp）,帽子 0 结构,图5-9 帽子 p161,mRNA帽子的生理功能：,促进某些RNA的合成。,帽子结构参与翻译起始，帽0结构是核糖体识别 mRNA所必需的；核糖体上有帽结合蛋白。,帽子结构增加mRNA的稳定性，保

23、护mRNA防 止其受5核酸外切酶的降解。,（二）3-端加上多聚腺苷酸尾巴(polyA)。,polyA的出现不依赖DNA模板。加尾信号：3-末端出现AAUAAA及下游的 GU丰富区。在两序列之间由特异的核酸内 切酶切除多余的核苷酸，然后加上poly A。尾部修饰和转录终止同时进行。3-端修饰也在核内完成，并先于mRNA中段 的剪接。polyA的有无及长短是维持mRNA作为翻译模 板的活性，以及增加mRNA本身稳定性的因素。,mRNA3-端的多聚腺苷酸化可被冬虫夏草素（3-脱氧胸苷）所阻止；即冬虫夏草素是多聚腺苷酸化的特异抑制剂。,二、rRNA前体的加工,原核细胞与真核细胞的rRNA前体都需加工：

24、,1、原核细胞 rRNA 基因与某些 tRNA 基因构成 混合操纵子。大肠杆菌共有7个转录单位，每个转录单位 由16S rRNA、23S rRNA、5S rRNA及 一个或几个tRNA基因组成。,图5-10 p163,大肠杆菌 rRNA 前体加工过程,2、真核细胞 rRNA 基因为串联重复序列：由18S rRNA、28S rRNA、5.8S rRNA基因 组成一个转录单位，彼此被间隔区分开。,每个重复单位之间的间隔DNA序列不转 录，称为非转录间隔序列。,真核生物 5S rRNA基因也是成簇排列的，中间隔以不被转录的区域，它由RNApol 转录，加工成熟后构成核糖体大亚基。,不同生物的 rRN

25、A 前体大小不同：哺乳动物为45S；果蝇38S；酵母37S；四膜虫35S,18S,5.8S,28S,18S-rRNA,5.8S和28S-rRNA,内含子,45S转录产物,剪 接,终产物,rDNA,基因间隔,哺乳动物细胞 rRNA 前体加工过程,tRNA前体,三、tRNA前体的加工,原核与真核tRNA基因大多成簇存在。,tRNA前体的加工包括：剪切内含子 核酸外切酶修剪3末端，逐个切去附加序列；加上CCA-OH的3末端，完成柄部结构。碱基修饰,tRNA的加工酶系包括：tRNA核苷酸转移酶、RNaseP、RNaseD、RNase等。,型：有CCA 序列基因，原核生物绝大部分；型：没有CCA序列基因

26、，为真核生物。,tRNA基因有两种：,原核生物与真核生物都有tRNA核苷酸转移酶，负责给型tRNA加上CCA3-OH末端，或修复发生损伤的型 tRNA 3-OH末端。,RNaseP、RNaseD RNase连接酶,1、剪切内含子：属于酶促反应，需要酶及ATP。,tRNA核苷酸转移酶,2、加上CCA-OH的3末端，完成柄部结构。,3、碱基修饰,四、RNA的剪接和RNA催化活性,真核不连续基因的初级转录产物中，外显子 与内含子交替出现；转录后把内含子切除而把外显子连接起来产 生成熟RNA分子的过程，叫RNA剪接（RNA splicing）。,内含子5端与3端都存在保守序列，分别 称为5剪接点（GU

27、）和3剪接点（AG）。,内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为四类。,I类：线粒体、叶绿体及低等真核生物细胞核 的rRNA基因；II类：线粒体、叶绿体的mRNA基因；III类：大多数核mRNA的基因；IV类：tRNA基因。,（一）第类和第类内含子的自我剪接特征,5剪接点 U GU 3剪接点 G AU近3保守序列 PyPuPyPyTAPy 5-P-Q-R-S序列 有 无能量输入 第一次亲核攻击 鸟苷酸 保守A2-OH,类 内含子 类内含子,（二）rRNA的自我剪接,四膜虫rRNA剪接由鸟苷酸发动第一次亲核 攻击，经过两次连续的转酯反应，将两个 外显子连接起来，释放出线形内含子

28、序列。,释放出的线形内含子序列再经过两次连续的 转酯反应，释放出15 核苷酸和 4 核苷酸的 两个小片段，最终形成稳定的线形产物L-19。（linear minus 19 intervening sequence）,L-19是四膜虫35S rRNA剪接的最终产物，仍具有酶的活性和特征。,pG-OH(ppG-OH,pppG-OH),剪接过程的二次转酯反应(twice transesterification),（三）RNA的催化功能,L-19具有酶的主要特征：专一性强，加快反 应速度，反应前后酶分子保持不变，这种由 RNA构成的酶称之为核酶。,核酶首先是美国 Colorado 大学Cech在研究

29、四膜虫rRNA剪接机制时发现的。他一方面证明了四膜虫rRNA的剪接机制；另一方面证明了L-19 分子的催化活性。,继而在1983年，耶鲁大学Sidney Altamn 发现了第二个核酶，参与 tRNA 前体加工的 RNaseP。1992年，加州大学的Harry Noller 又证明了核糖体大亚基rRNA的催化活性。,四膜虫rRNA内含子的二级结构,四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式,5-端核苷酸序列,最简单的核酶二级结构槌头状结构(hammerhead structure),底物部分,通常为60个核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份 催化部份和底物部份组成锤头结构,除rRNA外，tR

30、NA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。,核酶研究的意义,核酶的发现，对中心法则作了重要补充；核酶的发现是对传统酶学的挑战；利用核酶的结构设计合成人工核酶。,人工设计的核酶,粗线表示合成的核酸分子细线表示天然的核酸分子X 表示一致性序列箭头表示切断点,（四）tRNA的剪接,tRNA分子的内含子首先由核酸内切酶（RNase）剪去。最后由RNA连接酶完成连接。,（五)mRNA的自我剪接,除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,snRNP与hnRNA结合成为剪接体，进行剪接；参与mRNA剪切的snRNP包括U1、U2、U4、U5、U6,内含子上有3个保守性序列剪接位点：5端起始序列GU；3端AG

31、;距3端1840个核苷酸处有一个“分支点”，一定含A，由A发动第一次转酯反应。剪接过程是两次转脂反应。与类内含子相似。,（六）顺式和反式剪接,内含子剪接一般都是发生在同一基因内，切 除内含子，相邻的外显子彼此连接，这种剪 接称为顺式剪接（cis-splicing）。,反式剪接（trans-splicing）则是指发生在不 同基因之间的外显子的剪接。,反式剪接发现于几种锥虫和线虫中。都是在 mRNA 5端存在前导序列，称剪接前导RNA（splicing leader RNA，sl RNA）。sl RNA的反式剪接表现了核内剪接系统的进化。,概念：RNA编辑是指在转录产物RNA前 体的编码区内发生

32、核苷酸插入、丢失或转 换等现象。,五、RNA的编辑（mRNA editing）,近年发现某些mRNA前体的核苷酸序列需加 以改编，才能变成正确的有翻译活性的模板。mRNA的这种编辑作用广泛存在于原生动物及 植物细胞的线粒体。,6666位,哺乳动物载脂蛋白-B基因的转录产物即存 在mRNA编辑作用。,RNA编辑的生物学意义：,校正作用；调控翻译；如Apo-B基因在肠道的表达。扩充遗传信息：按照基因信息传递的理论，这种mRNA的编辑作用无疑是对传统分子 生物学原理的挑战。,复习题,1、解释概念：启动子、Pribnow框、Sextama框、TATA框、增强子、RNA剪接、顺式剪接、反式剪接、核酶、RNA编辑。,2、简述转录与复制的异同点。3、试述原核生物RNA聚合酶的组成及作用。4、简述真核生物RNA聚合酶的种类、特点、及其转录产物。5、原核生物与真核生物RNApol的启动子各 包括哪些序列？有何联系与区别？6、何谓终止子？比较原核生物两类终止子的异同。7、何谓增强子？试述增强子的作用特点。,8、试比较原核生物与真核生物转录的区别。9、mRNA前体与tRNA前体的加工包括哪些内容？10、试述mRNA的自我剪接机制及参与的因素。11、何谓核酶？核酶研究的意义如何？目前发现 的重要核酶有哪些？,