《质粒提取实验》PPT课件.ppt

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1、分子生物学实验,重组DNA技术质粒DNA的提取琼脂糖凝胶电泳,复 制,翻 译,转 录,不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接成新的DNA分子，这一过程称为DNA重组。,不同来源的DNA分子,重组DNA分子,重组DNA技术,基本过程,载体,携带目的基因转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。,作用：1、携带目的基因进入受体细胞2、使外源DNA在宿主细胞复制扩增或表达。,载体的特点,1.对受体细胞无害，不影响受体细胞正常生命活动2.具有自主复制能力3.含有多克隆酶切位点4.携带标记基因、便于筛选5.除保留必要序列外，载体应尽可能小6.生物安全性好,载体的类型,质粒,噬菌体,病毒,质粒 存在于细

2、菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子。,第一次实验,第二次实验,第三次实验,选,切、连,转筛,质粒DNA的提取,方法：碱裂解法原理：质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异,将菌液转移至1.5ml离心管中(尽量倒满)12000rpm/30s（重复一次）弃上清扣干，加入Solution 100L,剧烈振荡打散菌体，室温3min（以下操作要轻柔）加入新配制的Solution 200L,温和颠倒离心管45次混匀，室温放置3min（此时出现拉丝现象）加入预冷的Solution 150L,温和颠倒离心管23次混匀，室温3min 离心12000rpm/5min,具体步骤,质粒DNA的上清400 L移至

3、另一离心管中 加等体积氯仿,轻微振荡 离心12000rpm/2min 转移上清液350 L至另一离心管 加入2倍体积无水乙醇,轻轻混匀室温放置2min 离心12000rpm/5min 弃上清,加入70%乙醇洗涤沉淀 离心12000rpm/2min（重复一次）弃上清，液体尽量倒净并在吸水纸上扣干 室温放置15min干燥 加入TER 40L 溶解质粒,具体步骤,Solution I,1、蔗糖：增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。2、Tris-Cl：使溶液维持最适pH范围。3、EDTA：螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，抑制DNA酶活性，防止其对DNA分子的降解作用。

4、,蔗糖+Tris+EDTA,Solution II,1.SDS：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性2.NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性,SDS+NaOH,Solution III,1.中和溶液II的碱性，使DNA复性。2.K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。,KAc 与HAc,质粒的鉴定琼脂糖凝胶电泳,电泳：带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动的现象。作用：用于生物物质的分离分析 用于分析物质的纯度和分子量的测定等,电泳基本原理,当粒子稳定运动时：F=F 即 EQ=6r/E表示电泳迁移率，即单位电场强度粒子的运动速度，以表示：=/E=Q/6r,影响电泳的因素,溶液的pH值电场强度缓冲液的离子强度电渗作用,琼脂糖凝胶分离范围,实验流程 注意事项,1、制胶槽一定要放平2、倒胶时要慢，防止产生气泡,1、与上样缓冲液、染液混匀2、避免产生气泡3、小心防止戳破凝胶,1、看准正负极2、确定电路联通再离开3、及时停止,防止紫外线伤害,