《谷氨酸生产》PPT课件.ppt

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1、第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,1 谷氨酸生产菌的主要特征与菌学性质,现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。1.1 棒状杆菌属(Corynebacterium)直到微弯的杆菌，一端膨大呈棒状，折断分裂形成“八”字形或栅状排列。G+1.2 短杆菌属(Brevibacterium)短的不分枝直杆菌。G+1.3 小杆菌属(Microbacterium)杆状，与棒杆菌相似。G+1.4 节杆菌属(Arthrobacterium)培养过程中，球菌 杆菌，杆菌 球菌。G+G-,G-G+,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种

2、及扩大培养,2 国内谷氨酸生产菌及其比较,2.1 北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征(1)形态特征 短杆至小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，呈多种形态。单个、成对及“V”字形排列。G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,2 国内谷氨酸生产菌及其比较,2.1 北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征(2)培养特征 普通肉汁琼脂斜面：中间划直线培养，中度生长，菌胎线状，24h白色，48h淡黄色，颜色逐渐加深，表面光滑、湿润、有光泽，无黏性，无水溶性色素。普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，24h白色，48h淡黄色，中央隆起，表面湿润、光滑，有光泽，边缘

3、整齐且呈半透明状，无黏性，不产生水溶性色素。普通肉汁液体培养：稍浑浊，有时表面沿管壁呈薄环状，摇动培养管，底部有粒状沉渣。普通肉汁琼脂穿刺：表面发育良好，沿穿刺线生长弱，且不向四周扩散。明胶平板及明胶穿刺：菌落形状不规则，扁平，边缘不整齐，淡黄色。穿刺培养时，沿穿刺线生长不明显，表面发育良好。不液化明胶。马铃薯块：培养三周仍不生长。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,2 国内谷氨酸生产菌及其比较,2.1 北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征(3)生理特征 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。与温度的关系：菌株2637 培养生长良好，不耐高温，41 生长较弱。pH的影响：Ph510均能生

4、长，最适 pH67.5。还原硝酸盐：反映强烈。石蕊牛奶培养：7d后微产碱。不水解淀粉。不分解纤维素。脲酶试验：强阳性反应。产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖 生长因素试验：生物素是必需生长因素。硫胺素明显促生长。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,2 国内谷氨酸生产菌及其比较,2.2 钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征(1)形态特征 短杆至棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝。单个、成对及“V”字形排列。折断分裂。G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,2 国内谷氨酸生产菌及其比较,2.2 钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生

5、理特征(2)培养特征 普通肉汁琼脂斜面：中间划直线培养，中度生长，菌胎线状，近草黄色，表面湿润、无光泽，无黏性，不产生水溶性色素。普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，近草黄色，表面湿润、光滑，无光泽，边缘顿齿状，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。普通肉汁液体培养：稍浑浊，表面有薄菌膜，底部有较多沉渣。普通肉汁琼脂穿刺：表面及沿穿刺线生长，且不向四周扩散。明胶穿刺培养：表面及沿穿刺线生长。不液化明胶。马铃薯块：培养三周仍不生长。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,2 国内谷氨酸生产菌及其比较,2.2 钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征(3)生理特征 对氧的要求：兼性厌氧。与温度的

6、关系：菌株2037 培养生长良好，不耐高温，42 不生长。pH的影响：pH69生长良好，pH10生长微弱，pH45已不能生长。还原硝酸盐：反映强烈。石蕊牛奶培养：7d后微产碱。水解淀粉。不分解纤维素。脲酶试验：强阳性反应。产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵 生长因素试验：生物素是必需生长因子。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,2 国内谷氨酸生产菌及其比较,2.3 天津短杆菌(T613)的形态和生理特征(1)形态特征 典型的短杆状，有时微弯曲，两端稍钝圆，不分枝。单个、成对及“V”字形排列。折断分裂。G+。不运动。无芽孢。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种

7、及扩大培养,2 国内谷氨酸生产菌及其比较,2.3 天津短杆菌(T613)的形态和生理特征(2)培养特征 普通肉汁琼脂斜面：中间划直线培养，中度生长，菌胎线状、隆起，浅黄色，表面湿润、有光泽，不透明，不产生水溶性色素。普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，浅黄色，表面湿润、光滑，隆起，边缘整齐，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。普通肉汁液体培养：浑浊，没有菌盖，表面沿管壁有一圈菌膜，底部有棉絮状和粒状沉渣。普通肉汁琼脂穿刺：表面发育良好，沿穿刺线生长较弱，且不向四周扩散。明胶穿刺培养：表面发育良好，沿穿刺线生长不明显，不液化明胶。马铃薯块：培养15d仍不生长。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大

8、培养,2 国内谷氨酸生产菌及其比较,2.3 天津短杆菌(T613)的形态和生理特征(3)生理特征 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。与温度的关系：菌株2637 培养生长良好，75 处理10min不再生长。pH的影响：pH610生长良好，pH5生长微弱，pH4和pH11已不能生长。还原硝酸盐：反映强烈。不水解淀粉。不分解纤维素。脲酶试验：强阳性反应。产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵 生长因素试验：生物素是必需生长因子。硫胺素是促生长作用。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,2 国内谷氨酸生产菌及其比较,2.4 北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌(B9)的比较,后

9、提取容易，收率较高，质量较好,分泌色素较多,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,2 国内谷氨酸生产菌及其比较,2.5 天津短杆菌(T613)与钝齿杆菌(B9)的比较,T613感染噬菌体时，不能换用B9，调换7338.,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,2 国内谷氨酸生产菌及其比较,2.6 目前味精行业采用的主要菌株 钝齿棒杆菌B9和天津短杆菌TG-866是我国味精行业生产上的重要菌种。二者融合子F263.S9114 华南理工大学 FD415 上海复旦大学 TG961 天津科技大学,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,3 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化,3.1 种子

10、的菌体形态 斜面和一、二级种子在不同培养条件下，细胞形态基本相似。斜面培养的菌体较细小,一、二级种子比斜面菌体大而粗壮,革兰氏染色深。多为短杆至棒杆状,有的微呈弯曲状,两端钝圆,无分枝;细胞排列呈单个、成对及“V”字形,有栅状或不规则聚块;分裂的细胞大小为0.70.9*1.03.4um。由于生物素充足,繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,3 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化,3.2 谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态 长菌型细胞：发酵0-8h或0-10h。短杆至棒状，有的微弯曲状，细胞单个、成对及 V字形排列。转移期细胞：发酵8-18h或10-20h

11、。细胞开始伸长、膨大。在生物素贫乏的条件下，从谷氨酸非积累型转变成谷氨酸积累型。转移期有长菌型细胞，也有产酸型细胞。产酸型细胞：发酵16-20h后。细胞为含磷脂不足的异常状态，呈伸长、膨大、不规则状，缺乏V字形排列。发酵后期，细胞较长，呈有明显的横隔的多节细胞，产酸高。,过量生物素，不同阶段的细胞形态则基本上没有明显的变化。菌体较粗壮，类似于长菌型细胞。典型的异常发酵，长菌体、耗糖快、耗尿素快、发酵周期短、低酸或不产酸。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,3 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化,3.3 谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态 发酵前期感染噬菌体后,菌体细胞明显减少,细胞不规

12、则,发圆、发胖,缺乏字形排列,有明显的细胞碎片,严重时出现拉丝、拉网,互相堆在一起,几乎找不到完整的菌体细胞,类似蛛网或鱼翅状。在发酵中、后期感染噬菌体后,菌体细胞形态不规则,边缘不整齐,有的边缘似乎有许多毛刺状的东西,有细胞碎片。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,4 谷氨酸发酵的代谢控制育种,4.1 日常菌种工作 定期分纯小剂量诱变刺激高产菌制作安瓿管4.2 选育耐高渗透压菌种 耐高糖突变株耐高谷氨酸突变株耐高糖、高谷氨酸突变株,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,4 谷氨酸发酵的代谢控制育种,4.3 选育不分解利用谷氨酸的突变株 4.4 选育细胞膜渗透性好的突变株 生物

13、素亚适量、吐温-60、青霉素、温度敏感株4.5 选育强化CO2固定反应的突变株 CO2固定产四碳二羧酸，则糖酸转化率81.7%4.6 选育减弱乙醛酸循环的突变株 4.7 选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株 4.8 选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株 耐谷氨酸、谷氨酸结构类似物、谷氨酰胺抗性突变株4.9 选育强化能量代谢的突变株,1.切断或减弱支路代谢 选育减弱-酮戊二酸进一步氧化能力的突变株 从谷氨酸生物合成的代谢途径可以看出，减弱-酮戊二酸脱氢酶复合体的活性，可以使代谢流向谷氨酸，从而使谷氨酸得到积累。选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株 在谷氨酸生物合成途径中，

14、从葡萄糖到丙酮酸的反应是由EMP途径和HMP途径组成的。但是，通过HMP途径也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、芳香族氨基酸、辅酶Q、维生素K、叶酸等物质。这些物质的生成消耗了葡萄糖，使谷氨酸的产率降低。如果削弱或切断这些物质的合成途径，就会使谷氨酸的产率增加。这可通过选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促进生长的突变株以及抗嘌呤、嘧啶类似物或核苷酸类抗生素，如德夸菌素、狭霉素C抗性突变株来实现。选育不分解利用谷氨酸的突变株 为了积累谷氨酸，就必须使菌种不能分解利用谷氨酸，这可通过选育以谷氨酸为唯一碳源，菌体不长或生长微弱的突变株来实现。选育减弱乙醛酸循环的突变株 四碳二羧酸是由CO2固定反应和乙醛

15、酸循环所提供的。减弱乙醛酸循环，CO2固定反应所占的比例就会增大，谷氨酸的产率就高。这可通过选育琥珀酸敏感型突变株、不分解利用乙酸突变株、异柠檬酸裂解酶活力降低菌株来实现。阻止谷氨酸进一步代谢 由于细胞还可以谷氨酸为前体继续向下合成谷氨酰胺等，就必然会导致谷氨酸的积累量减少，为此，要避免谷氨酸被菌体利用，还需要切断谷氨酸向下的代谢途径。,GO BACK,2.解除菌体自身的反馈调节 选育耐高渗透压突变株 要使菌种能高产谷氨酸,首先要使菌种具备在高糖、高谷氨酸的培养基中仍能正常生长、代谢的能力，即在高渗培养基中菌体的生长和谷氨酸的合成不受影响或影响很小。这可通过选育耐高糖、耐高谷氨酸及耐高糖+高谷

16、氨酸突变株来实现。选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株 当谷氨酸合成达到一定量时，谷氨酸就会反馈抑制和阻遏谷氨酸脱氢酶，使谷氨酸的合成停止，使代谢转向天冬氨酸的合成。若解除了谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈调节，菌体就会不断的合成谷氨酸。这可通过选育酮基丙二酸抗性、谷氨酸结构类似物抗性（如谷氨酸氧肟酸盐）、谷氨酰胺抗性突变株来实现。,GO BACK,3.增加前体物的合成 选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株 这可通过选育柠檬酸合成酶活力强突变株及抗氟乙酸、氟化钠、重氮丝氨酸、氟柠檬酸等突变株来实现。选育强化CO2固定反应的突变株 这可通过选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源生长良好

17、的突变株、氟丙酮酸敏感突变株以及丙酮酸或天冬氨酸缺陷突变株来实现。,GO BACK,4.提高细胞膜的渗透性 选育抗Vp类衍生物突变株 选育抗Vp类衍生物，如香豆素、卢丁等突变株，都能遗传性的改变细胞膜的渗透性。选育溶菌酶敏感突变株。选育二氨基庚二酸缺陷突变株。选育温度敏感突变株 谷氨酸温度敏感突变株的突变位置是在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一个碱基所置换，这样为该基因所指导的酶，在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变。当控制培养温度为最适生长温度时，菌体正常生长；当温度提高到一定程度时，菌体便停止生长而大量产酸。,GO BACK,5.强化能量

18、代谢 谷氨酸高产菌的两个显著特点是:-酮戊二酸继续向下氧化的能力微弱和乙醛酸循环微弱，使能量代谢受阻，TCA循环前一阶段的代谢减慢。强化能量代谢可弥补上述两点不足，使TCA循环前一段代谢加强，谷氨酸合成的速度加快。选育呼吸链抑制剂抗性突变株 如可选育丙二酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株来实现。选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株 如可选育2,4-二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株来实现。3选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株 如可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株来实现。,GO BACK,6.其它遗传标记 据报道，选育异亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、AEC抗性、AHV抗性、棕榈酰谷氨

19、酸敏感等突变株，都可不同程度的提高谷氨酸的产酸率。,GO BACK,优先合成 谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸。谷氨酸脱氢酶(GDH)的调节 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈阻遏和反馈抑制。柠檬酸合成酶的调节 柠檬酸合成酶受能荷调节、谷氨酸的反馈阻遏和顺乌头酸的反馈抑制。异柠檬酸脱氢酶的调节 细胞内-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡。当-酮戊二酸过量时,将对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用,停止合成-酮戊二酸。-酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸产生菌中先天性的丧失或微弱。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。

20、,GO BACK,关于糖代谢的调节，主要包括：能荷控制：糖代谢的调节主要受能荷的控制，即受细胞内能量水平的控制。当生物体内生物合成或其他需能反应加强时，细胞内ATP分解，生成ADP和AMP，能荷降低。低能荷会激活某些催化糖类分解的酶或解除ATP对这些酶的抑制，并抑制糖原合成的酶(如糖原合成酶、果糖-1,6-二磷酸酯酶等)，从而加速糖酵解，使TCA循环产生能量，通过磷酸化作用生成ATP。当细胞内能荷高时，ATP增加，抑制糖原降解、糖酵解和TCA循环的关键酶，如糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸合成酶，并激活糖类合成所需要的酶，如糖原合成酶和果糖-1，6-二磷酸酯酶，从而抑制糖的分

21、解，加速糖原的合成。生物素的影响：生物素对糖代谢的影响，主要是影响糖降解速度，而不是影响EMP与HMP途径的比率。在生物素充足的条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也得到提高，但由于糖降解速度显著提高，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出。生物素对CO2固定反应也有影响。研究表明，生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固定反应。据有关资料报道,当生物素大过量（100g/L以上）时，CO2固定反应可提高30%。乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸的阻遏，为醋酸所诱导。以葡萄糖为原料发酵生成谷氨酸时，通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠

22、檬酸裂解酶的活性。因为丙酮酸氧化能力下降，醋酸的生成速率减慢，所以为醋酸所诱导形成的异柠檬酸裂解酶就很少。另外，该酶受琥珀酸阻遏，生物素亚适量时因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸-酮戊二酸谷氨酸的方向高效率地移动。,关于氮代谢的调节，众所周知，控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不能转化成其他氨基酸或参与蛋白质合成。在生物素亚适量的情况下，几乎没有异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，在铵离子适量存在下，生成积累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其他氨

23、基酸和合成蛋白质。在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性增强，琥珀酸氧化能力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酰乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其他氨基酸量增加。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,5 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌,5.1 原生质体融合5.1.1 操作步骤 标记菌株的选择 原生质体的制备原生质体的再生 原生质体的融合 融合子的选择 实用性菌株的筛选,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,5 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌,5.1 原生质体融合5.1.2 成功实例融合子F263 钝齿棒杆

24、菌B9(细胞个体大、易于提取；产酸率低)天津短杆菌TG-866(产酸率高)融合子F263(细胞个体大、产酸率高)融合子FTN9108T613 NTG诱变TN63(寡霉素抗性)TN115(氟乙酸抗性)融合子FTN9108(稳定、产酸率提高),第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,5 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌,5.2 转化法受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段，并将它整合到自己的基因组中，从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象。5.3 转导法通过温和型噬菌体为媒介，将供体细胞中的DNA片段携带到受体细胞中，从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象。,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,5 利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌,5.4 重组DNA技术（基因工程）操作步骤：工具酶和载体的选择 目的基因的制备 化学合成法、基因组DNA文库、cDNA文库、PCRDNA体外重组和外源基因的扩增与表达 重组DNA导入受体菌 重组体的筛选,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,6 菌种的扩大培养和种子的质量要求,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养,发酵罐,种子培养过程,第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养,6 菌种的扩大培养和种子的质量要求,影响种子质量的主要因素 培养基构成 温度pH 溶解氧 接种量 种龄,