《血清学反应》PPT课件.ppt

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1、第九章 血清学反应,8/1/2023,2,一 血清学反应的概念及一般特点 抗原及相应抗体在体内或体外均能发生特异性结合，在体外结合能发生可见免疫反应。由于抗体主要存在于血清中，故称为血清学反应。血清学反应根据抗原性质、反应条件、参与反应物质，则表现出反应有多种多样。其反应的一般特点是：,第一节 概 述,8/1/2023,3,（一）特异性和交叉性 血清学反应具有高度特异性。抗原只能与相应抗体结合，而不能与其他抗体相结合。生物体的组成是复杂的，包含有多种抗原成分，在进化过程中形成不同的种类，有各不相同的特异性抗原，在亲缘种系中往往含有部分相同的抗原成分，能引起交叉反应。,8/1/2023,4,（二

2、）结合的可逆性 抗原抗体结合是分子表面结合，这一结合受理化因素的影响，当温度超过60C或pH降至3以下时，则抗原抗体复合物又重新离群。离群后的抗原、抗体，其理化性质、免疫活性保留。,8/1/2023,5,（三）最适比与带现象 抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现可见反应。比例最适合，出现反应最快，反应产物愈多。如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一开始时即达到饱和，形成小的复合物则不能继续与相邻抗原、抗体结合，不出现可见反应，谓之区带现象或带现象。为了避免血清学反应的带现象，需要将抗原或抗体作适当的稀释。,8/1/2023,6,8/1/2023,7,比例不适合不能完成第二步反应 带现象,

3、8/1/2023,8,（四）反应的阶段性 抗原与抗体进行结合，可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段，反应快，几秒钟至几分钟即完成，但无可见反应；第二阶段为抗原与抗体的反应可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合等，反应进行较慢，需几分钟或更久。第二阶段受电解质、温度、pH值等影响。两个阶段在反应进行中无严格界限。,8/1/2023,9,（五）影响反应的因素1.电解质 血清学反应须在适当浓度的电解质参与下，才出现可见反应。在凝集、沉淀反应操作时，一般用生理盐水或8%10%高渗盐水作稀释，才出现较强反应。,8/1/2023,10,2.温度 温度升高，可增加抗原与抗体分子运动而碰撞接触，

4、加速反应的出现，故通常将抗原抗体混合后，放置37C温箱或水浴箱中，保持一定时间，促进反应。温度高，加速反应；温度低，反应时间延长，但反应结合充分，故在补体结合反应、免疫吸附实验中，采用低温放置过夜。,8/1/2023,11,3.酸碱度 血清学反应通常用pH68，过酸或过碱都可使复合物离群，pH值在等电点时，可引起非特异凝集。,8/1/2023,12,二 血清学反应的类型 沉淀、凝集、琼脂扩散、中和、补体结合和免疫吸附试验等。,8/1/2023,13,三 血清学反应的应用方式和目的 抗原抗体反应是特异性的，在应用时必须有一个是已知的，通过反应来鉴定另一个未知的。例如鉴定某一病原微生物时，多用已知

5、抗体。诊断传染病时，对慢性病可用已知的抗原检测未知的特异性抗体；诊断急性病则用已知的抗体检测未知的抗原（病原），如炭疽病等。,8/1/2023,14,（一）抗原与抗体的快速检测 在诊断传染病、寄生虫病、变态反应、肿瘤、自身免疫疾病时，均已广泛应用血清学方法检查抗体或抗原（细菌、病毒）的存在，作为诊断疾病的手段。现已应用的间接血凝技术、对流电泳、标记抗体技术，均能快速、简便的确诊抗原或抗体。,8/1/2023,15,（二）生物活性物质的超微定量 应用酶联免疫吸附实验、放射免疫等技术，抗原抗体检测的敏感度均大为提高，已达到能精确测出Pg的水平，其敏感度已大大超过了常规的化学分析。此类技术已应用于测

6、定动物体内的激素、维生素、药物及其他病理过程中的微量产物。,8/1/2023,16,（三）抗原或抗体在细胞与亚细胞水平的定位 用荧光抗体、酶标抗体技术，可以检测病毒或细菌在动物各种组织细胞中的分布。应用免疫酶组化法及铁蛋白标记技术进行免疫电镜观察，可以测定病毒在亚细胞水平的定位，也可测定淋巴细胞表面免疫球蛋白及抗体的产生情况。据此可分析传染病发生的机制及对免疫机理的探讨。,8/1/2023,17,（四）微生物的鉴定与分析 应用交叉凝集实验、凝集吸收实验、沉淀实验等血清学实验，进行微生物的鉴定及区别微生物的血清型，从而确定微生物的类型及其亲缘关系。还可应用琼脂扩散实验、免疫电泳等技术，对微生物的

7、抗原组分进行分析。,8/1/2023,18,（五）血型鉴定 用细胞直接凝集实验、血凝抑制实验、溶血实验等技术，可作血型鉴定、亲子关系的确定、新生儿和出生幼畜溶血病的诊断。,8/1/2023,19,第二节 沉淀试验,可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的絮状白色沉淀，称之为沉淀试验（Precipitationreaction test）。可溶性抗原+免疫血清 出现沉淀现象(血清蛋白、病毒)（抗体）比例适合 沉淀原 沉淀素 比例不适合 不出现沉淀现象,0.85%NaCl,8/1/2023,20,一 液相沉淀试验 1环状沉淀试验 原理：试管内，下层沉淀素与上层 沉淀原在液界面应

8、形成白色沉淀环。用途：检测皮毛中的炭疽 杆菌抗原（Ascoli试验）2絮状沉淀试验 抗原与抗体在试管内混合，在电解质的存在下抗原抗体复合物可形成絮状凝聚物。此法多用于毒素和抗毒素测定。,8/1/2023,21,二 琼脂扩散试验,琼脂是一种含有硫酸基的多糖，加热溶解于水，冷却后凝固成凝胶，琼脂凝胶是一种多孔结构，其孔径大小与琼脂含量有关，1%琼脂凝胶孔径为85nm，能使许多可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝胶中的一定位置上相遇时，则两者结合形成沉淀线。沉淀线的位置与抗原、抗体颗粒的大小、浓度，沉淀线的数目和所含抗原组分有关。琼脂扩散可分为单扩散（抗原或抗体中一种成分扩散）和双扩散。根

9、据其扩散的方向可分为单向单扩、单向双扩、双向单扩、双向双扩，其中双向双扩应用最广。,8/1/2023,22,1 单向单扩散,将0.6%-1%琼脂加热熔化后，加入定量经预热的稀释抗血清，混合均匀后，加入小试管中，待凝固后加入0.5ml抗原于其上，直立，置于37C中，2-3h后出现沉淀线。由于抗原的扩散，使沉淀线不断向下推移，而最初形成的沉淀带随抗原的扩散而向下推移，最后稳定。沉淀带距抗原愈近，其浓度愈大，可作抗原浓度测定。,8/1/2023,23,2 单向双扩散 基本作法同上，但在抗原与抗体之间加一层不含抗体的盐水琼脂，抗原与抗体均向中间琼脂扩散，形成沉淀带。主要用于抗原成分的分析。,8/1/2

10、023,24,3 双向单扩散 亦称辐射扩散。在平皿或玻板上进行。用2%缓冲琼脂盐水，加热融化，待冷后加入经预热的抗血清（用1：5-10倍稀释），混合后倒入平皿或玻板上，厚2-3mm。凝固后在凝胶板上打孔，孔径2-3mm，孔内滴加抗原液，放置湿盒中37C下扩散。抗原在孔内向四周扩散，与凝胶中的抗体接触，形成白色沉淀环，白环的大小随抗原的浓度而增大。此法在兽医临床上用于蛋白质定量实验。,8/1/2023,25,4双向琼脂扩散（琼扩）此法系采用1%琼脂倒于平皿或玻片上，制成凝胶板，可按需要打孔。将抗原、抗体分别滴入孔内，放置湿盒中，在37C湿箱中24-72h后观察。在抗原与抗体孔间形成沉淀带。每一种

11、抗原成分出现一条沉淀带。,8/1/2023,26,结果判断：如两个相邻孔之间抗原相同，则沉淀带融合；抗原则不同，则互相交叉；部分相同则部分融合，另外不同部分则交叉。,8/1/2023,27,特点：简便、敏感性低、耗时、应用最广用途：常用于细菌、病毒的鉴定，抗血清效价的测定，抗原组分的分析及传染病的诊断等，如马传染性贫血病的诊断。,8/1/2023,28,第三节 凝集试验,细菌、红细胞等颗粒状态的抗原与相应的抗体结合后，在电解质存在时相互凝集成絮片状团块，这种试验称为凝集试验（Agglutiation test）。参与反应的抗原叫凝集原；参与反应的抗体称为凝集素，主要有IgG、IgM。凝集实验有

12、直接凝集试验和间接凝集试验两种。,8/1/2023,29,基本原理：生理盐水颗粒性抗原+相应抗血清 颗粒凝集(细菌、红细胞)比例适合 凝集原 凝集素 过多 后带现象（稀释血清）,8/1/2023,30,一、直接凝集试验 颗粒性抗原与相应抗体在电解质的参与下，直接结合，凝集成团的现象，称直接凝集试验。按其操作方法可分为玻片发和试管法。,8/1/2023,31,1玻片凝集试验 将已知的抗血清1-2滴，滴于清洁玻片上，取待检菌液（抗原）加于其上，混合均匀，数分钟后可出现颗粒状或絮片状凝集，谓之阳性反应。特点：简单、快速 用途：定性，细菌鉴定、血型鉴定。如用已知的沙门氏菌血清，鉴定沙门氏杆菌的抗原组分

13、以定型。此法也用于畜禽传染病诊断，如用已知的鸡白痢有色平板抗原，检查鸡血清中有无相应抗体，进行鸡白痢检疫,8/1/2023,32,2试管凝集试验,是一种定性与定量相结合的方法。试验时用一列试管，将待检血清用0.5%石炭酸生理盐水作10倍递进稀释，每管维持量为0.5ml，一管不加血清作对照。每管中加入一定浓度的抗原0.5ml，混合均匀，在37C或室温下静置数小时，观察液体的亮度及沉淀物，视不同的凝集程度记录为+（100%菌体凝集），+（75%凝集），+（25%凝集）。,8/1/2023,33,凡能与一定量抗原发生50%凝集（+）的血清最高稀释度，为血清的凝集价或效价（滴度）。在试验时，必须建立阴

14、性、阳性血清对照管。特点：准确、耗时 用途：诊断布氏杆菌病，测定抗体的凝集价(定量),8/1/2023,34,二、间接凝集试验 基本原理：可溶性抗原+惰性载体（聚苯乙烯乳胶微粒、炭粒、绵羊红细胞等）抗原致敏载体 抗原致敏载体+相应免疫血清(抗体)电解质 被动载体凝集(间接乳胶凝集、间接炭素凝集、间接红细胞凝集等),8/1/2023,35,特点：敏感(在微量反应板中进行试验)、快速。用途：用已知抗原致敏的载体可检测血清中的特异抗体及其效价。若用已知免疫血清（Ab）致敏的红细胞，则可检测病毒等可溶性抗原称为反向间接血凝试验。,8/1/2023,36,8/1/2023,37,（正向）间接凝集反应原理

15、示意图,8/1/2023,38,（反向）间接凝集反应原理示意图,8/1/2023,39,间接凝集抑制反应原理示意图A：标本中含抗原 B：标本中不含抗原,8/1/2023,40,第四节 与补体有关的试验,一、补体的性质 补体是存在于正常动物血清中的一组蛋白质。补体没有特异性，它能与任何抗原抗体复合物相结合，但不能与游离的抗原或抗体相结合。补体与抗原抗体的复合物结合后，可出现溶血反应、溶菌反应、补体结合反应、凝集反应、免疫黏膜试验等。由于补体具有这一特性，故常用其来检验抗原或抗体是否发生特异性结合，特异性抗原或抗体是否存在。,8/1/2023,41,二、溶解试验1.溶血试验 红细胞与相应的抗体（溶

16、血素）相结合后，在补体的参与下，可发生溶血反应（直接溶血反应），以作补体结合反应的指示系统。吸附抗原的红细胞与抗体结合后，在补体存在下可以引起溶血反应，这种反应称为间接溶血反应。间接溶血反应只能用新鲜红细胞，而新鲜红细胞不易保存，限制了本法的应用。,8/1/2023,42,2.溶菌试验 某些细菌（如霍乱弧菌）与抗体结合后，如有补体存在，可发生细菌溶解或被杀死，这种反应称为溶菌反应或杀菌反应。,8/1/2023,43,三补体参与的试验补体结合试验 补体结合试验是应用可溶性抗原与相应抗体结合,其抗原抗体复合物可以结合补体,但这一反应肉眼看不到,如再加入致敏红细胞,即可根据是否出现溶血反应判断反应系

17、统中是否存在相应的抗原和抗体.,8/1/2023,44,1参与反应：抗原抗体反应系统、补体（豚鼠血清）、指示系统（绵羊红细胞、溶血素）。2反应原理：（如下图所示）。3特点：敏感性特异性高。正式试验前要进行下列测定，操作较繁（溶血素效价、补体效价、抗原效价）。4用途：用于牛肺疫、副结核、布氏杆菌病、锥虫病、马传贫、鼻疽等的检疫。,8/1/2023,45,8/1/2023,46,中和试验（病毒、毒素中和试验）原理：病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易 感动物、鸡或鸡胚、细胞活性。例1 NDV 911d鸡胚 2448h 鸡胚死亡NDV+抗血清 911d鸡胚 鸡胚不死亡,第四节 中和试验,8/1/2

18、023,47,例2 口蹄疫病毒(FMDV)47d乳鼠 乳鼠死亡 FMDV+抗血清 47d乳鼠 乳鼠不死亡 用途：1.用已知血清鉴定病毒诊断病毒病2.用已知病毒检测血清抗体诊断病毒感染，测定病毒免疫血清效价（中和价）。,8/1/2023,48,第六节 免疫标记技术,免疫标记技术即是将某一个特定的易于检测的分子或原子，联结在抗体或抗原上，利用抗体（或抗原）能与相应的抗原（或抗体）结合的特性，从而检测抗原或抗体的存在及所在部位（定位）。免疫标记技术是近年来研究血清学反应的一项新技术。它不仅可以用于抗原抗体的定性、定量，还可用于抗原抗体的定位。由于其反应的特异性敏感性高，不但在诊断疾病时广为应用，亦可

19、应用于生物领域其他方面。,8/1/2023,49,1.荧光标记抗体技术（免疫荧光技术）免疫荧光技术是将荧光染料标记在抗体球蛋白分子上，制成荧光抗体。当荧光抗体与相应抗原结合时，就形成带有荧光的抗原抗体复合物，在荧光显微镜下，可观察到此复合物发出的荧光。可检测标本中某种抗原的存在或抗原所在的部位（定位）。原理：荧光素（F）+Ab AbF(FITC）)AbF+Ag Ag-AbF Ag-AbF 用途：用AbF检测抗原（定性、定位）特点：敏感，需荧光显微镜,紫外光,8/1/2023,50,方法：直接法 F 间接法 F Ag Ag比较：检测一种抗原 标记一种动物的免疫 就须标记特异 球蛋白AbF，就能

20、的一种AbF 检测多种抗原 较特异 较敏感,8/1/2023,51,2.酶标记抗体技术（酶免疫测定技术）（1）间接法（2）双抗体夹心法原理：用途：已知抗原、酶标 已知血清抗体、酶 抗体测血清抗体 标抗体测抗原,8/1/2023,52,3.放射免疫测定法原理：Ag+AbR Ag-AbR 或 AgR+Ab AgR-Ab 用液相闪烁仪测R放出的射线量特点：敏感性极高，需高级闪烁仪 同位素对人有放射性危害用途：用于药物、激素、酶、肿瘤抗原等测定,8/1/2023,53,四、其他免疫标记技术,（一）免疫电镜技术（二）生物素-亲和素标记技术（三）核酸探针技术,8/1/2023,54,第七节 葡萄球菌A蛋白

21、及其应用,葡萄球菌A蛋白是大多数金黄色葡萄球菌细胞壁上所含的一种成分，具有多种生物学特性，能与人及多种哺乳动物的IgG的Fc段呈非特异性结合，结合后仍保持其抗体活性。同时与酶、荧光颜料偶联，因而应用于免疫领域。,8/1/2023,55,一、葡萄球菌A蛋白的主要特性,葡萄球菌A蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种成分，存在于细菌表面，结合于黏肽中。对热稳定，经100度1h后仍保持与IgG结合的活性。葡萄球菌A蛋白可以与人及多种哺乳动物（如猪、兔、小白鼠）的IgG结合，并在琼脂中形成沉淀线。这种结合是一种假免疫反应，是一种与IgG Fc段非特异的化学结合，结合后能激活补体，亦仍保持Fab的免疫活性。

22、这一活性，已应用于免疫学领域中。,8/1/2023,56,二、葡萄球菌A蛋白在免疫学上的应用,（一）协同凝集试验 细胞壁上葡萄球菌A蛋白与抗体结合，被覆着特异性抗体的金黄色葡萄球菌与相应的抗原结合时，就可使互相联结引起协同凝集反应。这种方法应用于多种细菌和某些病毒的快速诊断。试验方法常采用玻片法，也可采用试管凝集法，每种方法均应设不含葡萄球菌A蛋白的阴性菌液对照。,8/1/2023,57,（二）标记葡萄球菌A蛋白技术 从富含葡萄球菌A蛋白的菌株中，提取葡萄球菌A成分，用酶、荧光染料标记，代替标记第二抗体，用于检测抗体或抗原。此法可避免制造第二抗体的麻烦，保存期长，因而广泛应用于实验室诊断中。end,