《蛋白质的表达》PPT课件.ppt

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1、An Example of protein investigation,Expression of protein,Xuexi Yang,人工合成尿素,自然界的矿物等无机物千年万年，亘古不变，是没有生命的；而有机物不同，是有生命的。无机物-有机物（生命）动植物体内存在着一种生命力，只有依靠这种生命力，才能产生出有机化合物，即有机物只能在有生命生物体内产生。化学家在实验室只能将有机物转化为新的有机物，而不能用无机物制造出有机物。,2NH4Cl+AgCNONH4CNO+AgClNH4CNO（热）（NH2）2CO,有机化学第一人-维勒（1800-1882）,蛋白质的生物合成,胰岛素有生物活性的蛋白质

2、,In vitro：in vitro protein synthesis system Prokaryotic Expression System-E.coli,B.subtilis In vivo yeast Eukaryotic Expression System insect cells mammalian cells,.Expression system,香蕉与奶牛,.Prokaryotic Expression System,Escherichia.coli,because of the wealth of knowledge regarding its biochemistry a

3、nd genetics can be considered a good first choice for the preparation of proteins.However,E.coli might not yield protein suitable for analysis,then other systems must be examined,1.基因表达在原核生物与真核生物中的差别？,原核生物表达系统和真核生物表达系统具有各自的特点。在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA，与此同时，mRNA立即与核

4、糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5和3末端后才形成mRNA。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。,2.真核基因在原核系统表达的困难及其解决方法,将真核基因克隆到1个强大的原核promotor和SDs的下游,使真核基因处于原核启动子的控制之下,转录物由于原核SDs能与核糖体rRNA结合,可在原核表达.这是克服1,2困难的好办法.从真核分离出mRNA并逆转录成cDNA,cDNA有完整的编码顺序,但无内

5、含子是采用伪装办法将真核基因插到原核基因某密码之后,其翻译产物N端有原核多肽,这样表达的融合蛋白,可躲避细菌蛋白酶降解作用.,1.细菌RNApol不能识别真核的promotor,故真核基因不能被该酶转录.2.从真核转录的mRNA缺乏SD序列,不能结合到细菌核糖体rRNA,因此不能被翻译成蛋白.3.真核基因有内含子,而原核细胞缺乏真核细胞转录后加工系统,成熟的mRNA不能形成,不能表达真核蛋白;4.表达的真核蛋白在原核细胞中不稳定,易被细菌蛋白酶降解.,3.大肠杆菌表达载体的组件,复制起始点 origin of replication选择性基因 selection marker多克隆位点 MCS

6、 启动子 promoter终止子 terminator核糖体结合位点 ribosome binding site,Prokaryotic Expression System,复制起始点,保证载体可以正确复制和增殖pBR322和pUC的复制起点，它们皆来源于ColE1质粒 质粒具有不相容性 通常表达载体都会选用高拷贝的复制子,选择性基因,至少有一个选择性基因，可用于转化体的确定，并可在培养过程中保持质粒的稳定性。LB倒板前加抗生素的温度 超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢,多克隆位点,具有单一酶切位点的多克隆位点，便于外源基因的插入,3.1启动子,启动子(promoter,P)是指能

7、被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。-10区（pribnow box）和-35区组成分类转录形式组成型诱导型强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。,P tac=3 P trp=11 P lac,启动子,转录调控机理 具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）正调节因子 CAP 负调节因子 lac I,IPTG诱导启动子-Lac,Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA,lacI Plac l

8、acO lacZ lacY lacA,Lac 表达系统 正调节因子 CAP cAMP激活CAP，CAPcAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合 后，能促进 RNA 聚合酶与 35、10 序列的结合，进而促进 Plac 介导的转录。,基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5,Lac 表达系统 lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。,Lac 表达系统 负调节因子 lac I 在

9、无诱导物情形下，lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA,转录调控机理 色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有 效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中 往往添加 IAA 诱导 Ptrp 介导的目的基因表达,IAA诱导启动子-Trp,Trp 表达系统 以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设

10、计、构建的表达系统,Trp 表达系统,Tac 表达系统 tac 启动子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5 的 10 序列拼接而成的杂 合启动子。调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平更高于 trp 和 lacUV5 启动子（P tac=3 P trp=11 P lac），因此在要求有较高基因表达 水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。,杂合启动子-Tac,PL 和 PR 表达系统 以 l 噬菌体早期转录启动子 PL、PR 为核心构建的表达系统 在野生型 l 噬菌体中，PL、PR 启动子转录与否决定了 l 噬菌体进入 裂解循环还是溶源循环。

11、,温度诱导启动子-PL 和 PR,PL 和 PR 表达系统 转录调控的机理 由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL、PR 启动子转录的 阻遏物。cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI 基因产物的产生和消失是相当困难的。因此 PL、PR 表达系统都选用温度敏感突变体 cI 857(ts)的基因产物 来调控 PL、PR 启动子的转录。在较低温度（30）时以活性形式存在 在较高温度（42）时失活脱落,T7 表达系统 大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一 体系中的元件为基础

12、构建的表达系统称为 T7 表达系统。,最常用启动子-T7,T7 表达系统 T7 噬菌体编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启 动子的转录。T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转 录的序列。在细胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆 菌宿主本身基因的转录竞争不过 T7 噬菌体转录体系，最终受 T7噬 菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。,T7 表达系统 转录调控的机理 T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA

13、聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。,T7 表达系统 转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 启 动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。,T7 RNA 聚合酶基因,lac 启动子,E.Coli（DE3）,IPTG诱导,T7 表达系统 转录调控的机理 温度诱导型 PL 启动子控制 T7 RNA 聚合 酶基因，通过热诱导方式激发 T7 噬菌体启动子的转录。这种方式可以使本底转录降到 很低

14、的水平，尤其适用于表达 对大肠杆菌宿主有毒性的重组 蛋白质。,T7 RNA 聚合酶基因,PL 启动子,E.Coli（CE6）,热诱导,cI857,T7 表达系统 转录调控的机理 双质粒系统 一个质粒带有 T7 RNA 聚合酶 基因，另一个质粒带有 T7 启 动子和目的基因 两个质粒的复制子和抗性标记 不能相同 调控方式为控制 T7 RNA 聚合 酶的启动子调控类型,热诱导,3.2 The Terminator,Stops RNA synthesis at specific points along the DNA template The enzyme stops polymerising n

15、ucleotides into RNA,releases the RNA chain and leaves the DNA to eventually reinitiate at another promoter.Features:A dyad symmetry in the DNA,centered 15 to 20 nucleotides before the end of the RNA this leads to a transcript that can form an hairpin loop Run of about six As in the DNA template whic

16、h are transcribed into Us at the end of the RNA,How could these two structuralfeatures cause termination?,强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物。过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应增加，外源基 因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 D

17、NA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其 它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外 源基因编码产物的翻译效率,终止子,强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特 殊结构，以增强其转录终止作用,终止子,核糖体结合位点 外源基因在大肠

18、杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA 翻译的起始效率主要由其 5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）,3.3核糖体结合位点,核糖体结合位点 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的 68 个核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的 16S rRNA 3 端区域 3 AUUCCUCC 5 并与之专一性结合 将m

19、RNA 定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的 起始位点，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区 5 端若干密码子的碱基序列,核糖体结合位点,4.常见原核表达系统,面面俱到Novagen 因为纯化爱上你-GE（原安玛西亚）更快克隆Invitrogen,面面俱到Novagen,面面俱到Novagen,是否要用基因本身的起始密码子进行选择 是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体 你希望用蓝白斑筛选可以使用pETBlue系列载体 除了传统的酶切、连接方式外，还有不需要连接

20、的克隆方式Novagen提供菌株种类多种菌株:BL21,Rosetta,Origami除了常用培养基LB、TB、M9、M9ZB 等：可以直接进行过夜培养培养基Overnight Express Autoinduction System Novagen还有表达双外源蛋白的载体pCDFDuet-1 DNA、pETDuet-1 DNA、pRSFDuet-1 DNA：最多可以同时表达8个外源蛋白 有许多不同系列的载体、菌株供选择；与原核表达的各种相关产品都一应俱全：载体、菌株、培养基、检测表达的抗体、纯化产品,抗性和标签,BL21:lon,ompT BL21(DE3):T7 polymeraseRos

21、etta:optimal codons Origami:thioredoxin reductase(trxB),glutathione reductase(gor)Rosetta-gami Origami B:(IPTG concentration dependent),菌株种类,菌株种类,蛋白酶缺陷型都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型，这包括有BL21,Origami,Rosetta。可以保持蛋白的稳定不被降解。保证所有细胞以同样量进行表达Origami B和Rosetta这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达。蛋白表达浓度可以随着IPTG浓度而改变。通过对IPTG浓度的控制可以

22、使细胞微量表达或者大量表达。二硫键形成与溶解性增强Novagen专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还原酶（trxB）缺陷型的，包括BL21trxB，Origami，Origami B和Rosetta-gami。可以更大程度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。稀有密码子的补给Rosetta是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA。硒蛋氨酸标记B834是来源于BL21的蛋氨酸（met）营养缺陷型菌株。它在高度特异活性35S-met标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。,因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）,作为蛋白纯化的专

23、家,GE的原核表达系统以便于产物纯化而见长。融合表达系统的pGEX是我们极为熟悉的GST亲和纯化表达系统,其表达产物纯化体系已经非常成熟。选择表达系统的时，表达后的纯化方法是必需考虑的非常重要的问题。,因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）,通用电气医疗集团(GE Healthcare)安玛西亚：ECL，Sepharose、Sephadex,因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）,因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）,GST是一个高度可溶的蛋白，可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到一种促进表达量提高的作用。对于表达分子量小的目标蛋白来说选择GST就比6xHis tag

24、 更有优势 GST纯化填料的专一性则非常高,因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）,GST系列总共有13个载体。有9个的多克隆位点是扩展过的，有6个限制性酶切位点。载体上都有将GST切割下来的蛋白酶识别位点，可以分成T系列、X系列和P系列，分别采用凝血酶Thrombin、Xa因子蛋白酶以及GE的PreScission蛋白酶。pGEX所有载体都提供了三种不同的翻译读码框选择；都是利用乳糖操纵子调控模式，启动子都是Ptac。,因为纯化爱上你:GE（原安玛西亚）,在表达后的检测和纯化方面，GE医疗的产品堪称经典：Western Blot检测表达，纯化亲和层析柱，即使GE医疗没有6组氨酸标记的载体，但是6

25、组氨酸亲和纯化相关产品却绝对出色 纯化是表达后绝对不可小视的一步。所以，“因为纯化爱上你”，就是选择pGEX的最好理由吧！,更快克隆Invitrogen,Invitrogen是TA克隆的创始者定向TOPO克隆完全不需要酶切和传统连接反应，五分钟就可以做出一个克隆。其他载体主要用传统的酶切、链接方式做重组质粒，Invitrogen的表达系统大量运用TOPO技术和Gateway技术Invitrogen有四个原核表达系统：Champion pET Expression System、HisPatch ThioFusion System、pBAD Inducible Bacterial System、

26、pL System和T7-based Systems。几乎囊括所有启动子。,5.表达前的分析比什么都重要,翻译起始位点GC含量二级结构基因或者蛋白的大小亲疏水性,成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。,6.避免外源基因表达蛋白降解的对策,构建融合蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建包涵体表达系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统,7.大肠杆菌表达研究四重境界,初次尝试扫盲篇 乱棍打枣入门篇 系统优化中级篇 自成一体高手篇,Eukaryotic Expression System,1.Yeast Expression Systems2.Baculovirus Expression Sys

27、tems3.Animal cells Expression Systems,1.酵母表达系统,酵母表达系统既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点。最先被研究和应用的是酿酒酵母体系，但酿酒酵母系统由于缺乏强有力的启动子、分泌效率差、表达质粒易于丢失等缺点，逐渐被甲醇酵母表达系统代替，其中毕赤酵母应用最为广泛。,1.1毕赤酵母表达系统的特点,优点：1）含有强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。3）发酵工艺成熟。已经有大规模工业

28、化高密度生产的发酵工艺,1.1毕赤酵母表达系统的特点,缺点：利用易燃的甲醇做原料，表达产物的卫生安全性需要考虑筛选药物价格昂贵也给生产应用带来局限信号肽加工不完全，修饰功能欠完善以及内部降解等现象，给外源蛋白的纯化和工业化带来了困难。,1.2甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子,甲醇酵母（methylotrophic yeast)指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。毕赤酵母（Pichia pastoris)汉森酵母（Hansenula ploymorpha)假丝酵母（Candia boidinii),1.2甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子,甲醇氧化酶启动子A、目前已发现的、最强的真核启动子B、严谨调控型启动子

29、AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导,1.3毕赤酵母表达系统模式载体,1.4 选择标记,营养缺陷型选择标记His4、Ura3、Leu2抗性选择标记G418、Amp,2.杆状病毒表达系统,杆状病毒只来源于无脊椎动物。基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒 多角体基因缺失后，并不影响后代病毒的感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒的功能。,杆状病毒表达系统的原理,NPV基因组巨大，不适于体外操作，需构建一个能与NPV基因组DNA重组的转移载体

30、质粒。转移质粒载体上含有多角体蛋白基因的启动子及多角体蛋白基因的旁侧序列。将目的基因克隆至转移载体的多接头的合适酶切位点处，使其处于多角体基因启动子的控制之下。重组转移载体与野生型病毒DNA共转染昆虫细胞，目的基因通过细胞内同源重组而插入病毒基因组中。利用空斑形态的差异进行筛选、纯化重组病毒，再以纯化的重组病毒感染昆虫细胞，即可获得大量的外源基因表达产物。,杆状病毒表达系统的特点,重组蛋白具有完整的生物学功能：表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。能进行翻译后的加工修饰：修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致，但修饰的寡糖种类却不完全一样。表达水平高：与其它真核表达系统相比，最突出的特点就是

31、能获得重组蛋白高水平的表达，最高可达到细胞总蛋白的50。能容纳大分子的插入片段：能同时表达多个基因：既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。不足：非连续性表达；表达产物的糖基化相对简单，多不分支。,与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。与大肠杆菌相比，哺乳动物细胞的表达水平低、获得高表达细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等

32、导致哺乳动物细胞生产蛋白质的成本较高。,3 哺乳动物细胞表达系统,表达需要转录后修饰的基因研究蛋白的生物合成和体内细胞间的转运机制表达大肠杆菌和酵母不能表达的含有内含子的基因序列 哺乳动物细胞是最理想的表达人类基因的系统，应为首选。,哺乳动物细胞表达系统,体外翻译系统（In vitro translation system）又称之为体外蛋白质合成系统(in vitro protein synthesis system)，是一种细胞裂解物，这种系统只有翻译功能，当加入外源mRNA，能量物质和氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经SDSPAGE后可检测出翻译活性。常用翻译系统有以下几种：1.兔网织细胞裂

33、解物(reticylocyte lysate system)2.小麦胚抽提物(wheat germ extract)3.两栖动物卵母细胞 4.原核体外翻译系统,体外翻译系统,Commonly confronted questions,Should the protein(s)be expressed in bacteria,in yeast,in insect cells or in human cells?Which expression vector should be used?If bacterial expression is used,which strain(s)should b

34、e chosen?Should one express the fulllength protein or a fragment thereof?Should the protein be tagged,and which affinity tag is the best?What is a good purification strategy,and what are the common pitfalls?,Unfortunately,because every protein is different,there can be no right answer to any of thes

35、e questions a priori.,How to choose protein expression system,Choice of host(system)Choice of vectorChoice of tagChoice of strains,1.Choice of host,bacteria,fungi,plants,insect or mammalian cells grown in culture,and transgenic animals or plants“My Expression System is Better than Yours”Syndrome-The

36、re is no one expression system that does everything well,Each system has its strengths and weaknesses,The amount and the degree of purity of the product,as well as its biological integrity and potential toxicity should be considered.The expression of each cDNA or gene presents its own peculiar set o

37、f problems.The synthesis of foreign protein is still largely empirical.,2.Choice of vector,The choice of vector family is largely governed by the host.The expression of a recombinant protein fused to a tag of known size and biological function can greatly simplify subsequent purification and detecti

38、on,Expression of fusion proteins,Advantages:1.foreign proteins are often rapidly degraded by host protease,and this may sometimes be avoided by a gene fusion strategy.2.General and efficient purification schemes maybe obtained which allow rapid recovery of gene products.3.the proteins can be localis

39、ed to different compartments of the host cell(periplasm,cell wall,culture medium)through specific peptides fused to the protein.,Disadvantages The fusion peptide may prevent the correct folding of the recombinant protein and alter its properties.For that reason the bacterial segment should be remova

40、ble,usually chemically or enzymatically.Even after removal of the fusion peptide some proteins have been unable to achieve the correct folding,3.Choice of tag,The two most commonly used tags are(histidine)6 and GST,4.Choice of strains,BL21:lon,ompT BL21(DE3):T7 polymeraseRosetta:optimal codons Origami:thioredoxin reductase(trxB),glutathione reductase(gor)Rosetta-gami Origami B:(IPTG concentration dependent),思考题,原核表达载体主要有那些组件？重组蛋白质的表达系统主要有那些？各自的优缺点是什么？,参考文献,毕赤酵母表达操作手册pET System Manual，3.蛋白质工程，王大成，化学工业出版社，2002,