《蛋白质与氨基酸》PPT课件.ppt

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1、蛋白质与氨基酸,主要介绍氨基酸、肽和蛋白质的结构、性质、功能以及蛋白质的结构与功能的关系。还介绍了一些基本技术如氨基酸的分离、纯化，多肽的人工合成，蛋白质的分离、纯化、鉴定等。,一、蛋白质的重要性和一般组成,（一）重要性,有些蛋白质是生物体的结构物质，,有些蛋白质是生物体的功能物质。,近年来的研究还指出蛋白质在遗传信息的控制，细胞膜的通透性以及高等动物的记忆等方面起了重要作用。,总而言之，一切重要的生理活动都离不开蛋白质，蛋白质是生命现象的最基本的物质基础。,几年前，在欧洲乃至全世界引起恐慌的疯牛病，其致病元凶就是蛋白粒子（prion），这种只有蛋白质而没有核酸的病原体，可引起人或动物的疯牛病

2、，这一发现又一次说明了蛋白质是生命的物质基础。,（二）一般组成,元素组成：所有蛋白质都含有 C、H、O、N 四种元素，大多数蛋白质还含有少量的 S，有些蛋白质还含有一些其它元素，如 P、Fe、Cu、Mo、I等。,各种蛋白质的含氮量都很接近，都在16%左右，因此可通过测定生物样品中的含氮量计算出样品中蛋白质的含量，1克氮就相当于6.25克蛋白质。,蛋白质水解：用H+，OH-或酶将蛋白质彻底水解，可以得到许多种氨基酸的混合物，说明氨基酸是蛋白质的基本结构单位。,二、蛋白质的基本结构单位氨基酸（amino acid,aa或AA）,（一）氨基酸的通式、分类、结构和代号,1、氨基酸的通式,或,2、氨基酸

3、的分类、结构、代号,氨基酸有两种分类方法,(1)按侧链R基的结构,(2)按侧链R基的极性,中性氨基酸,氨基酸的结构、代号:,（二）氨基酸的构型、旋光性和光吸收,构型：组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。,以丙氨酸为例：,如含两个手性碳原子，则有种立体异构体，分别称为-,-，别-和别-氨基酸。,L-苏氨酸(L-threonine),D-苏氨酸(D-threonine),L-别-苏氨酸(L-allo-threonine),D-别-苏氨酸(D-allo-threonine),蛋白质中的氨基酸都是L-型

4、。,(Gly除外),旋光性：,组成蛋白质的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用“一”号表示，向右旋转的称右旋，用“”号表示。,旋光度，比旋光度,消旋,外消旋,内消旋,光吸收：,组成蛋白质的氨基酸中，Trp、Tyr和 Phe对紫外光有一定的吸收，这是因为它们分子中含有苯环，是苯环的共轭双键造成的，这三个氨基酸的光吸收都在280nm附近。,（三）氨基酸的酸碱性质和等电点,1、氨基酸的两性离子形式,两性离子(dipolar ion),2、氨基酸的两性解离和等电点,Brnsted的酸碱理论，即广义酸碱理论。,HA A-+H+,酸,

5、碱,质子,氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质。,As an acid（proton donor）：,As a base（proton acceptor）：,不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在：,正离子,两性离子,负离子,氨基酸所带静电荷为“零”时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（isoelectric point），以pI表示。,实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。,当溶液的pH=pI时，氨基酸主要从两性离子形式存在。,pHpI时，氨基酸主要以

6、正离子形式存在。,pHpI时，氨基酸主要以负离子形式存在。,3氨基酸的酸碱滴定曲线,酸碱滴定曲线,4等电点的计算,中性氨基酸：以Gly为例,H+2=K1K2,pH=（pK1+pK2）/2,pI=（pK1+pK2）/2,酸性氨基酸，以Asp为例：,碱性氨基酸，以Lys为例：,（四）氨基酸的化学性质,1-氨基参加的反应,（1）成盐作用,（2）与HNO2的反应,（3）与甲醛的反应,甲醛滴定要注意几点,甲醛滴定的优缺点,（4）酰基化反应,酰氯：,苄氧酰氯（Cbz-Cl）:,对甲苯磺酰氯(Tos-Cl):,叔丁氧酰氯(Boc-Cl):,酸酐：,邻苯二甲酸酐：,（R酰基）,Cbz-Cl,Cbz-氨基酸,氨

7、基酸与 5一二甲氨基萘-1-磺酰氯（dansyl chloride,DNS）的反应,（5）烃基化反应,与2、4一二硝基氟苯的反应,2，4一二硝基氟苯,（R烃基）,DNFB,DNP-氨基酸（黄色）,与苯异硫氰酸（酯）的反应,PITC,2-羧基参加的反应,（1）成盐和成酯反应,酰化氨基酸对-硝基苯酯,（活化酯）,（式中Y酰基）,（2）成酰氯反应,（3）成酰胺反应,体外：,体内：,（4）脱羧基反应,（5）叠氮反应,3.-氨基和-羧基共同参加的反应,（1）茚三酮反应,注意几点：,（2）成肽键,4侧链R基参加的反应,（1）-S-S-和-SH的氧化还原反应,R-SH：HS-CH2CH2OH 巯基乙醇（me

8、rcaptoethanol）,HS-CH2COOH 巯基乙酸（mercaptoacetic acid）,HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）,半胱氨酸的-SH很活泼，很容易在空气中重新氧化形成二硫键，一般可用卤代化物对-SH进行保护。,（2）苯环的黄色反应,（3）酚基的Millon反应（米伦氏反应）,（4）pauly反应,（5）Folin一酚反应,（6）紫外吸收：Trp、Tyr、（phe）,（7）荧光：Trp、Tyr、（phe）,氨基酸化学性质总结,（五）氨基酸分析,1分配层析法：,CA：一种物质在A相（流动相）中的浓度,CB：一种物质在B相

9、（固定相）中的浓度,（1）逆流分溶（逆流分配）,（2）纸层析,单向纸层析图,Rf值,双向纸层析图,（3）聚酰胺薄膜层析,（4）薄层层析,2离子交换层析法,原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。,这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关。,离子交换树脂：,化学本质：是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物。,外观：,阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基-SO3H

10、（强酸型），羧基-COOH（弱酸型）,阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基-N+(CH3)3OH-,茚三酮显色：仪器灵敏度10-9mol,OPA（邻苯二甲醛），荧光胺：,灵敏度10-12mol。,3高效液相层析（high performance liguid chromatography,HPLC）,HPLC的特点:,（1）反相层析（reverse phase chromatography）,（2）离子交换层析,（3）凝胶过滤,HPLC可使氨基酸分析的灵敏度达到10-12mol水平。,HPLC：,（六）氨基酸的制备,1蛋白质水解,（1）酸水解,（2）碱水解,（3）酶水解,2人工合成,3微

11、生物发酵,三、肽（peptide）,（一）肽的结构和命名,肽是由两个或两个以上的氨基酸通过肽键连接而形成的化合物。,二肽 三肽 四肽,二肽+肽称寡肽（oligopeptide）,多肽（Polypeptide）,氨基酸之间通过肽键连接形成的链称肽链。,N端,氨基酸残基,氨基酸残基,C端,肽链书写方式：N端C端,肽链有链状、环状和分支状。,命名：根据氨基酸组成，由N端C端命名,丙氨酰甘氨酰亮氨酸 AlaGlyLeu(or AlaGlyLeu),（二）肽的理化性质,1两性解离与等电点,肽与氨基酸一样具有酸、碱性质，它的解离主要取决于肽链的末端氨基、末端羧基和侧链R基。,由于肽中N端自由氨基和C端自由

12、羧基之间的距离比氨基酸中的大，因此它们之间的静电引力较弱。肽中C端-COOH的pK略大于氨基酸中的pK值，pK1。N端-NH+3的pK略小于氨基酸中的pK值，pK2。R基的pK变化不大。,肽的等电点：肽所带净电荷为“零”时，溶液的pH值。,例：已知末端-COOH，pK3.6，末端-NH3+pK8.0-NH+3pK10.6。计算Ala-Ala-Lys-Ala的等电点。,pI=(8.010.6)/2=9.3,2肽的化学性质,肽的化学性质与氨基酸相似，如两性解离、等电点等，但肽有与氨基酸不同的特殊反应,（1）双缩脲反应,（2）肽键的紫外吸收210230nm,（三）天然存在的某些活性肽,1肌肽和鹅肌肽

13、,肌肽（carnosine）:-Ala-His,鹅肌肽（anserine）：-Ala-1-Me-His,2谷胱甘肽(glutathione,GSH),3多肽抗菌素,4多肽激素,5神经肽,甲硫氨酸脑啡肽TyrGlyGlyphe-Met,亮氨酸脑啡肽Tyr-Gly-Gly-phe-Leu,功能：镇痛,如脑啡肽(enkephalin),（四）肽的人工合成,1概况,20世纪初 E.Fischer：以氨基酸为原料合成了一个十八肽。,1932年 M.Bergman:Cbz,1953年美国 Du.Vigneaud：生物活性的催产素,1965年中国：生物活性的牛胰岛素,1962年美国Merrifield：固相

14、合成法,2合成方法,（1）液相合成法,用缩合剂的方法,氨基保护基Y：Cbz、Boc、Tos,羧基保护基Z：甲酯（OMe）CH3O-,乙酯（OEt）C2H5O-,苄酯（OBzl）,叔丁酯（OBut）,缩合剂：N，N一二环己基碳二亚胺（N，N-dicyclohexyl carbodiimide，缩写DCCI或DCC）,脱去氨基保护基的方法：,Boc用酸，如50%三氟醋酸脱去,Tos用钠氨还原法,脱去羧基保护基的方法：,苄酯（OBzl）用催化加氢法,叔丁酯（OBut）用酸，如50%三氟醋酸脱去,Cbz用催化加氢法,甲酯或乙酯用皂化法,将参与肽键合成的羧基和氨基活化,羧基的活化:,氨基的活化：,接肽时

15、加入有机碱如三乙胺或KHCO3等，保证氨基处于自由状态，氨基即活化。,早期用酰氯，但反应太激烈，后来采用叠氮法，而现在用了最多的是活化酯法和混合酸酐法。,液相合成的优缺点,（2）固相合成法,（3）酶促合成法,固相合成的优缺点,四、蛋白质的分类,（一）根据蛋白质分子的形状,1球状蛋白质（globular protein）,2纤维状蛋白质（fibrous protein）,（二）根据组成和溶解度,1单纯蛋白质（simple protein）:也称简单蛋白质，完全由氨基酸组 成的蛋白质。,单纯蛋白质的分类（根据溶解度的不同）,(1)清蛋白（albumin）：溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液。如血清清 蛋

16、白。,(2)球蛋白（globulin）：不溶于水而溶于稀盐溶液，如血清球蛋白。,(3)谷蛋白（glutelin）：不溶于水、醇及中性盐溶液，但溶于稀酸、稀碱，如米谷蛋白。,(4)谷醇溶蛋白（prolamine）：不溶于水，但溶于70%80%乙醇，如玉米醇溶蛋白。,(5)组蛋白（histone）：溶于水及稀酸溶液，分子中含Arg、Lys 较多，呈（弱）碱性，如小牛胸腺组蛋白。,(6)鱼精蛋白（protamine）：溶于水及稀酸溶液，分子中含碱性 氨基酸特别多，呈（强）碱性，如鲑精蛋白。,(7)硬蛋白（scleroprotein）：不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液。如胶原蛋白、角蛋白、丝心蛋白、弹性蛋

17、白等。,2缀合蛋白质（conjugated protein）：也称结合蛋白质，由蛋白质和非蛋白质两部分组成。,缀合蛋白质的分类（根据非蛋白质即辅基的不同）,(1)糖蛋白（glycoprotein）：含糖类，如胶原蛋白。,(2)脂蛋白（lipoprotein）：含脂类，如血浆脂蛋白。,(3)核蛋白（nucleoprotein）：含核酸，如核糖体。,(4)磷蛋白（phosphoprotein）：含磷酸，如酪蛋白。,(5)金属蛋白（metalloprotein）：含金属，如铁蛋白含Fe。,(6)血红素蛋白（hemoprotein）：辅基为血红素，如血红蛋白。,(7)黄素蛋白（flavoprotein

18、）：辅基为黄素（FAD或FMN），如琥珀酸脱氢酶（含FAD）。,（三）根据功能,1.活性蛋白质（active protein）,包括生命活动过程中一切有活性的蛋白质以及它们的前体分子，绝大多数蛋白质属于活性蛋白质，包括酶、激素蛋白、运输蛋白（转运蛋白）、贮存蛋白、运动蛋白、保护或防御蛋白、受体蛋白、控制生长和分化蛋白、毒蛋白、膜蛋白等。,2.非活性蛋白质（passive protein）,对生物体起支持和保护作用，主要指硬蛋白包括胶原蛋白、角蛋白、丝蛋白、弹性蛋白等。,五、蛋白质的结构,当多肽的分子量大到足够具有一定的空间结构时就称为蛋白质。,蛋白质与多肽的主要差别：分子量，空间结构,为了对蛋

19、白质结构叙述的方便，人为地将蛋白质的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。,蛋白质的一级结构又称初级结构，二级结构、三级结构、四级结构的三度空间排列称蛋白质的空间结构、高级结构、三维结构或构象。,随着蛋白质化学研究的进展，越来越多的人认为在二级结构和三级结构之间应加入超二级结构和结构域这两个层次，所以蛋白质的结构层次为：,一级结构,二级结构,超二级结构,结构域,三级结构,四级结构,（一）蛋白质的一级结构（primary structure）,1定义：,蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序（sequence），一级结构的主要连接键是肽键。,2蛋白质一级结构的测定,概况:,

20、序列测定前的准备工作：,样品的纯度,相对分子质量,肽链的数目,氨基酸组成,一级结构的测定主要用小片段重叠的原理,序列测定方法,（1）末端分析：包括N端分析，C端分析,N端分析方法,二硝基氟苯法（DNP法、DNFB法或FDNB法）,丹磺酰氯法（DNS法）,苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法）,氨肽酶（aminopeptidase,Apase）法,Ala,Val,Gly,亮氨酸氨肽酶（Leucine amino peptidase,LAP）,专一性:,A=非极性氨基酸时 快,A=其它氨基酸时 慢,A=Leu时 最快,N端氨基封闭的几种情况,C端分析,硼氢化锂还原法

21、,肼解法：也称联氨法,羧肽酶（carboxypeptidase,Cpase）法,4种羧肽酶的来源和专一性,（2）肽链的拆开和分离,共价键,非共价键,（3）肽链的部分水解,化学方法：,溴化氰（CNBr）裂解法:,酶解方法,（4）肽段的分离和氨基酸序列测定,（5）找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列,（6）二硫键位置的确定,对角线电泳,（7）酰胺基位置的确定,3蛋白质测序举例,insulin,4指纹图谱（finger print）法,近年来由于DNA序列的测定发展很快，可将相应于蛋白质的DNA序列测定出来后，推出蛋白质的序列，为蛋白质一级结构的测定带来了新的曙光。,一级结构测定展望,5蛋白质序列数据库,(1)PIR（Protein Information Resource）数据库,(2)SWISS-PROT数据库,