《蛋白纯化系统》PPT课件.ppt

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1、BioLogic DuoFlow中高压层析系统,层析原理与操作,为什么做蛋白质纯化？,原理与操作,纯度均一的蛋白质才能满足物理化学性质研究、生物活性测定、免疫学性质、结构分析、药理毒理实验的要求，以揭示生命科学的规律。研究开发、中试生产蛋白质药物用于诊断和治疗。,实验室研究,A、天然生物样品,纯度均一的蛋白质,纯化,B、重组基因工程药物,C、蛋白质组研究,差异蛋白质,质谱测序,克隆表达,分离纯化蛋白质是生命科学研究的基本且必要的技术手段，也是生物制品药物生产的最重要的工艺步骤！,其他生物分子分离纯化,原理与操作,其他生物大分子：DNA，多糖生物小分子：多肽和小肽，核苷酸，寡糖和单糖，多环和杂环

2、,用途：用于性质、活性等研究需要用于治疗和诊断的药物用于生物、化工或食品等轻工领域的生化试剂,离心沉淀超滤电泳层析(Chromatography),生物分离纯化技术,原理与操作,Model 491，Rotofor,Note:蛋白质分离纯化的重要问题是如何在纯化过程中保持温和的条件，从而保证在此过程中蛋白质的结构和活性不受影响。,最广泛的蛋白质分离纯化方法 条件温和 维持蛋白质空间结构与活性,什么是生物层析,根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离 极性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP 离子特性：ionic characteristics(charge

3、)IEX 大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF 结构特征与活性位点：shape(ligand binding,affinity)AC 这些特性的区别使不同生物分子分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离,原理与操作,层析技术,Ion Exchange(IEX)离子交换电荷 可用于 层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化Size Exclusion(SEC)分子筛（或凝胶过滤）分子大小 用于中间纯化、脱盐和缓冲液交换、最后精细纯化Affinity(AC)亲和生物相互作用 用于复杂样品的最早捕获或中间纯化Hydro

4、phobic Interaction(HIC和RP)疏水和反相疏水相互作用-用于中间纯化，去除脂类和脂多糖Ceramic Hydroxyapatite(CHT)&Ceramic Fluoroapatite(CFT)羟基磷灰石独特分离机理，包含离子交换和金属螯合等,可用于 层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化,原理与操作,层析的5个操作步骤,装柱并平衡上样平衡洗脱再生,上样,装填有层析介质的层析柱,分离,分离组分流出,原理与操作,原理与操作,层析图,第一峰,外水体积,Vo,不与柱中填料相互作用直接从柱中流出。这是样品中的未结合物质,Vo,Ve,Vt,蛋白质含量(A

5、280),由UV检测器读出，y轴,基线,洗脱峰，有些可以很好的分离，有些分得不是很好，有部分交叉,时间或体积，x轴,液相层析系统的工作流程,用Pump推动溶液各种Valve系统选取溶液控制流向通过 Column 时不同蛋白分子与填料作用强度不同因而迁移速度不同从而分开Column 洗脱液包含的蛋白.通过检测器确定位置和浓度Fraction Collector收集样品,原理与操作,液相层析系统,仪器结构,DuoFlow 10/40系统,DuoFlow 工作站,电导检测器,MX-1 梯度混合器,AVR7-3 样品进样阀,USB Bitbus 信号转换器,液晶显示器,电脑,BioFrac方形组分收集

6、器,UV 检测器,DuoFlow中高压层析系统,Maximizer阀系统,QuadTec 紫外/可见检测器,Maximizer 混合器,SV5-4 阀,AVR9-8 阀,pH 检测器,DuoFlow Basic DuoFlow QuadTec Maximizer Pathfinder,DuoFlow中高压层析系统,工作流程,DuoFLow,生物相容性100%bio-compatible所有接触溶液的系统以新型塑料peek为主溶液系统不接触任何金属件，避免蛋白变性和吸附化学稳定性化学稳定性,基本特征,DuoFLow,兼容所有层析填料,基本特征,DuoFLow,F10梯度泵：20.0 ml/min

7、 at 3500psi(233 bar,23MPa)高压中流速的泵头可满足HPLC高压液相分析和小规模制备的要求F40梯度泵：80 ml/min at 1000psi(66bar,6.6 MPa)中压高流速的泵头可满足大规模制备，包括中试和生产的要求,DuoFLow,特色:可更换的双泵头,只要旋下泵头前的4根螺丝，将另一泵头安上即可实现高压中流速和中压高流速的切换,DuoFlow可将高压中流速和中压高流速两种仪器的性能通过独特的泵头更换技术整合在一台仪器中。,灵活多样、功能强大的扩展配置,DuoFLow,特色,Easy to learn Software,强大的分析、管理和报告功能，通过软件整

8、合和控制所有硬件:Maximizer,QuadTec,2128,BioFrac,pH Monitor,all valves,DuoFLow,特色,Maximizer,使F10和F40梯度泵流速增加一倍，压力不变情况下达到20 ml/min or 80 ml/min，用于工艺优化、中试放大四元缓冲液梯度混合，寻找最佳PH和离子强度以优化工艺增加阀的数量，达到6低压6高压阀，灵活配置你的层析系统连接第三方检测器,DuoFLow,功能组件,Maximizer,DuoFLow,功能组件,Peek材质，良好化学稳定性密封的甘汞电极防止电极液干涸甘汞不与混冲液中的金属离子结合，防止堵塞响应时间提高，检测结

9、果更加准确和精确,PH检测器,DuoFLow,功能组件,检测范围：pH014检测灵敏度：0.01,UV、电导检测器标配254/280 nm滤光片检测DNA、蛋白214 nm+锌灯选件检测肽链滤光片选件313 nm356 nm405 nm436 nm546 nm 外接其它检测器，如折光仪,DuoFLow,功能组件,QuadTec UV/Vis 检测器同时四波长检测 DNA,peptides,Proteins,DuoFLow,功能组件,波长范围：190-740nm四波长同步检测波长精确性：1nm,DuoFLow,功能组件,QuadTec,14种可选收集架，可以放冰浴，保证样品活性整合在duoflo

10、w中，多种程序(窗口和阀限)收集可用在HR,LP,Econo中,BioFrac Fraction 组分收集器,DuoFLow,功能组件,DuoFLow,功能组件,BioFrac Fraction 组分收集器,Make-before-break 高压阀 AVR7-3 高压上样阀AVR9-8 高压转换阀各种低压阀SV5-4低压阀，缓冲液选择SVT3-2低压阀，溶液选择或转向灵活应用各种阀和辅助泵构建随意层析系统,DuoFLow,功能组件阀系统,2xAVR7-3阀构建逆向层析系统，用于亲和层析,仅需切换第二个AVR7-3阀位置即可,DuoFLow,阀系统,2xAVR9-8实现8柱切换,DuoFLow

11、,阀系统,DuoFLow,阀系统,AVR9-8辅助泵实现自动切换上样,DuoFLow,阀系统：柱串联,去除血清中高丰度蛋白：IgG和HSA以用于2D电泳分析,DuoFLow,阀系统：柱串联,利用各种阀构建级联层析系统，实现特定目的A:样品经阀1 柱1 阀3 阀4 收集器B:特定组份经阀4 阀2Loop 柱2 阀3、4 收集器,前一柱子流出的特定组份直接上第二根柱子二次分离,DuoFLow,阀系统,阀系统：2D-LC（Liquid Chromatography）,样品：蛇毒1D Column：Uno Q强阴离子交换柱2D Column：Hi-Pore RP 318 C18反相分析柱1D柱第11组

12、分由阀门导向样品环中，继续1D色谱分析，完毕后，自动进行2D反相柱的平衡，然后进样（1D第11组分），进行2D反相分析。,第一维色谱，UNO Q1离子交换,第二维色谱，RP C18反相，第一维11管组分在第二维分成多个组分,第一维第11管组分1mL经过检测器后没流到收集器中，而是流到第二维色谱的进样环中，所以以空白表示，没标以灰色,DuoFLow,3XAVR7-3实现三柱级联前一柱子未结合的蛋白进入第二、三根柱子，三根柱子可以独立洗脱第一根柱子独立上样、洗脱，组份经换向阀进入第二根柱子，独立洗脱，组份经换向阀进入多三根柱子，独立洗脱收集,DuoFLow,阀系统,BioLogic DuoFlow

13、 Basic SystemBioLogic DuoFlow Standard SystemBioLogic DuoFlow QuadTec Basic SystemBioLogic DuoFlow QuadTec Standard SystemBioLogic DuoFlow Maximizer 20 SystemBioLogic DuoFlow Maximizer 80 SystemBioLogic DuoFlow PathFinder 20 SystemBioLogic DuoFlow PathFinder 80 System,一套组件，根据需要配置多种平台，组件共享，资源共享,DuoFL

14、ow,DuoFLow,软件系统,非常直观，易学简单明快，4个步骤进入操作：Browser Setup Protocol Run观察样品情况,调节色普图和峰高度or Go Do Something Else!2 次击键进入操作:Browser Run观察样品情况,调节色普图和峰高度or Go Do Something Else!,DuoFLow,软件系统,Manual Screen,DuoFLow,软件系统,Browser Enter User and Method Name,DuoFLow,软件系统,Setup select hardware,DuoFLow,软件系统,Protocol ent

15、er method,DuoFLow,软件系统,Post Run Options-Activity,DuoFLow,软件系统,Post Run OptionsPeak Tagging,DuoFLow,软件系统,Post Run Options TRACE COMPARE 层析图比较,单一柱子单一程序走不同样品单一样品和单一程序走不同柱子同一样品和柱子走不同程序,DuoFLow,软件系统,DuoFLow,软件系统,DuoFLow,软件系统,液相层析系统,应用,层析是如何物质实现分类,根据分子物理化学特性的不同而达到分离 极性：polarity(solubility,volatility)HIC,R

16、P 离子特性：ionic characteristics(charge)IEX 大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF 结构特征与活性位点：shape(ligand binding,affinity)AC 这些特性的区别使不同分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离,层析技术在大分子分离纯化的应用,抗体制备生产以及免疫学研究,层析技术,酶工业生产以及酶学研究,蛋白质结构和功能研究,其他研究的进行组分分离或者样品制备等,其他生物活性分子功能研究,蛋白质结构功能研究方面,一、结构生物学和蛋白质功能研究均需要高纯度的蛋白质二、层析技术是蛋白质纯化最

17、好的手段三、层析技术能够满足样品的高纯度、高活性的要求,蛋白质结构生物学研究策略,选择基因,表达载体构建,纯化目的蛋白,蛋白质结晶,组织提取,基因工程细胞表达.,多维核磁共振,X射线,解析结构,数据收集,利用层析进行蛋白质纯化是蛋白质研究的基础,层析技术在抗体生产中的应用,层析技术是纯化捕获抗体的最佳手段,层析技术在天然产物分离和中医学上的应用,中草药活性成分在生命科学中的定位,基因组 蛋白质组次生代谢产物组,DNA,RNA,蛋白质（酶）,次生代谢产物,基因工程药物,中药活性成分,天然产物活性成分,色谱,液相层析系统,注意事项,1.仪器使用过程中常遇到如下问题：压力读数或流量脉动，可能是气泡滞陷在泵头，参考仪器手册赶出气泡；紫外基线脉动或噪音过大，可能是气泡滞陷在检测池；反压过大，可能是管道堵塞或柱子需要清洗。取下柱子，如果反压仍过大，需清洗管道和阀门（可以从泵开始逐段检查找出堵塞处），否则按柱子说明书清洗或再生柱子。2.最好联系仪器管理员处理有关问题。如果问题仍不能解决，拨打Bio-Rad 维修热线800-820-5567。,常见问题处理,