血片染色与原虫镜检.ppt

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1、疟原虫镜验技术,四川省疾病预防控制中心寄防所康杨,2个阶段：人体内发育阶段（无性分裂）蚊体内阶段（有性生殖）2个宿主:中间宿主-人 终末宿主按蚊 2个时期:红细胞外期（肝细胞内期）红细胞内期。裂体增殖周期:间日疟、卵形疟48小时；三日疟72小时；恶性疟36-48小时。,疟原虫的生活史,按蚊,库蚊,伊蚊,三种蚊子停留姿态,蚊体 人体,肝细胞 红细胞,唾腺（红外期）,囊合子 子孢子 裂殖体 裂殖子 环状体,休眠子 裂殖子 大滋养体,速发型,迟发型,动合子 裂殖体,雌配子 雌配子体,合子,雄配子 雄配子体,红外期裂体增殖,红内期裂体增殖,配子生殖,孢子增殖,配子体形成,生活史 基本发育过程（以P.v

2、为例）,(life cycle),分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是确诊疟疾的“金标准”仍然是血液显微镜检查显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方法厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代的疟疾诊断的金标准,实验室技术,厚薄血膜的制作,血片制作,在制作血片前，首先要核对患者的姓名、年龄和住址,取血部位和血量,采血部位和取血方法：耳垂或无名指（婴儿足跟或脚趾），通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小。,厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血

3、量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径0.81厘米大小圆形厚血膜。薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适当远的地方.将采血玻片(推片)的边缘紧贴载玻片使 血液沿边缘散开(如图示).,正确的推片姿势,标准的疟疾厚薄血膜片位置,各种不同的疟疾血片涂制法：,标准血片,门诊发热病人血片,居民普查血片,厚薄血膜的标准,厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列,血膜的制作,血膜编号 血膜制成后，立即用特种蜡笔或水笔于玻片面上写上受检者的号码，以防差错，待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个

4、人编号，依次顺序插入标本盒内。,制作血膜的注意事项,1.玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。,制作血膜的注意事项,2.刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不一溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开放置一段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚血膜红蛋白被其固定，不能

5、溶血或染色效果不佳。,制作血膜的注意事项,3.血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能2448小时内固定染色；冬天也不能超过72小时。放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定（13分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。,染色过程,将血片平置于染色板上。用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血膜上，染色2040 min。用清水细缓冲去染液。置玻片于插板上，自然晾干。,血片干燥后,用甲醇固定薄血膜。,血片染色,两种染色方法:吉氏染色法瑞氏染色法 常用吉氏染色法,（一）染液的种类,染液种

6、类：对镜检疟原虫染色虽然种类名称很多，但都是从罗门诺夫斯基氏创造的多色性染液变化过来的。多色性染液可分为水溶液和醇溶液两类。水溶液类有罗氏（Romanowsky）染液、费氏(Field)染液等；醇溶液有吉氏（Giemsa）染液、瑞氏（Wright）染液等。,（一）染液的种类,水溶液类:罗氏（Romanowskys）染剂早在1891年由罗门诺夫斯基发明。还有费氏（Fields）和J.S.B（Jaswanant Singh&Bhattacharji）染剂。均为分成甲、乙两种染液的复式染剂。,（一）染液的种类,醇溶液类:有吉氏（Giemsa）染液、瑞氏（Wright）染液等。是在水溶液染液的基础上改

7、进发展而成。目前我们推荐的是运用醇溶液类中的吉氏（Giemsa）染液,（三）吉氏染液母液配置方法,取吉氏粉0.5克置于研钵中，加少量甘油充分研磨，再加再磨，至25毫升加完为止，倒入60或100毫升带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量甲醇，洗去甘油浓液混入瓶内，至25毫升甲醇洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置于5560水浴中或温箱内24小时或室温内35天，多加摇动，即成原液。吉氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经久不变。,材料：1、吉氏粉0.5克 2、甘油25毫升 3、甲醇25毫升,稀释吉氏原液,原液需经pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）或净水稀释后，方可用于厚薄血片染

8、色。吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果.,（三）吉氏染液血片染色方法,先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后才进行染色。成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性蒸馏水98毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色30分钟（如染液不合标准时，得酌情增减染色时间），然后用清水轻轻将染液冲去，再用清水轻轻冲洗一次，干净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干镜检。,血片的染色（三）吉氏染液血片染色方法,先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。亦可在固定薄血膜后用清水对厚血膜

9、溶脱血红蛋白，然后才进行染色。单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，用2%吉氏染液稀释液12毫升，滴入血片标本上染色30分钟左右，或用中性蒸馏水1毫升，加吉氏母液12滴，混合均匀后滴入血片标本上，染色1020分钟，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。,操作1（快染）配制5%染液，（每张血片约需染液2ml）：量筒内量2ml缓冲液或净水，直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。操作2(慢染)在染色量筒内量2ml蒸馏水或净水，再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色3040min。清水细缓冲洗，晾干镜检。,吉氏染液浓度,门诊染色,质量

10、好的染色:核呈红色,胞浆呈蓝色 如果血片偏红,说明染液偏酸性如果血片偏蓝,说明染液偏硷性,外观吉氏染色血片,瑞氏染液的配制：,将瑞氏染剂粉1g置于研钵内，加入15ml甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用500ml甲醇洗出研钵中的甘油溶液，倒入瓶中，摇匀后，置室温下，每天摇动5分钟，3天后即可使用。此方法染色的时间短，但染色效果不如吉氏染液效果稳定，又不能大量血片染色，可用于门诊应急血片只用。,瑞氏染液的染色方法：,先用蜡笔在厚、薄血膜间划一界限，滴几滴蒸馏水在厚血膜上溶血。溶血后倾去水滴。在薄血膜上加瑞氏染液58滴，染色12分钟。然后再加58滴蒸馏水于薄血膜上，用吸管将染液与蒸馏水混合均匀后

11、，把染液引到厚血膜上，使厚血膜再染色10分钟。用清水轻轻冲去染液，晾干。,血片制作与染色注意事项,使用前载玻片一定要清洁，不然会影响 血片制作和镜检结果 厚血膜干燥时不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果 配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量,固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜,冲洗染液时，不要冲走厚血膜。,影响染色效果的因素,血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏等有关外，还受到以下几个因素的影响：（1）染料溶剂的质量 染料、甲醇和甘油如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇和中性甘油，而且在配制时所用的器具必须干净而无水份。,影响染色

12、效果的因素,（2）染液的新旧 新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制12周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。,影响染色效果的因素,（3）染液稀释后使用时间 吉氏和瑞氏染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用，一般在半小时内染色力最强。,影响染色效果的因素,（4）染液的稀释浓度 染液的浓度高其着色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不明显

13、或消失。,影响染色效果的因素,（5）染色时间 染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。因此染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。,影响染色效果的因素,（6）染色用水 染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择Ph7.07.2清洁水，通常使用的新鲜的蒸馏水或过滤的冷开水，以及自来水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏碱，可用缓冲蒸馏水调整。染色后发现血膜颜色偏蓝（偏碱）或偏红（偏酸）时，可用与之相反的酸、碱度水冲洗血片予以纠正。,影响染色效果的因素,（7）染色后不要直接将染液倒掉，应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出，并轻轻冲洗

14、，以免染液色素颗粒沾污血膜。,如何确定疟原虫血片为阴性,检查全部厚血膜未查见疟原虫 最少检查100个厚血膜油镜视野未查见 疟原虫,显微镜的一般构造,1.镜座 9.粗调节器 17.滤光镜圈 2.镜柱 10.细调节器 18.反光镜3.镜臂 11.齿板4.倾斜度关节 12.镜台5.镜筒 13.推动器6.接目镜 14.弹簧夹7.旋转盘 15.聚光器8.接物镜 16.虹彩,血片的镜检,1.在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜中各种血细胞的形态、内部结构和染色性质加以识别。2.学习镜检疟原虫，首先要学看薄血膜，在基本上掌握薄血膜中疟原虫形态后，才学习镜检厚血膜。3.镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜仅

15、作为原虫分类时参考和血片编号之用。4.镜检疟原虫必须用油镜头配合5X低倍目镜镜检，当发现疑难问题时可调换10X目镜进行观察。5.检查时应从厚血膜的上缘开始，使血膜从上而下，自左至右，由右至左，一行接一行，一个视野稍叠一个视野顺序地查完整个血膜。,人类四种疟原虫的 基 本特征,感染人的疟原虫有四种:,恶性疟原虫 P.falciparum 间日疟原虫 P.vivax三日疟原虫 P.malariae 卵形疟原虫 P.ovale,恶性疟 P.falciparum,四种疟原虫中致病力最强 无免疫力者感染后出现急性症状,不及时治 疗可危及生命 在我国主要流行云南省和海南省,间日疟 P.vivax,间日疟原

16、虫分布于我国大部分地区，主要是中部地区 引起间日疟,病程呈良性,但有复发,三日疟 P.malariae,三日疟在我国已基本消灭主要发生在晚秋及初冬,无复发 卵形疟 P.ovale又称蛋形疟原虫,在我国已基本消灭引起症状与间日疟相似,但很少复发,四种疟原虫的 诊断要点,环状体纤细,红细胞不涨大一个红细胞内可有几个环状体 环状体内可有2个核 环状体可贴在红细胞边缘 血片中没有其他发育期原虫 配子体呈新月形或腊肠形 可出现茂氏点,恶性疟（P.falciparum）鉴定 要点,红细胞通常涨大 薛氏点明显 成熟环状体粗大滋养体有阿米巴样伪足可见不同发育期的原虫,间日疟（P.vivax）鉴定要点,环状体可

17、呈方形带状形是特点 成熟裂殖体呈菊花状,内含612个裂殖子 红细胞不涨大，略缩小有时有西门氏点,三日疟（P.malariae）诊断要点,卵形疟（P.ovale）诊断要点,红细胞略涨大或不变大 红细胞边缘呈车轮状环状体有时呈现鱼眼状薛氏点明显 成熟裂殖体类似三日疟原虫,但更粗大原虫呈卵圆形,薄血膜中疟原虫寄生时 红细胞的变化,镜检示教,以下血片采自现症病例,A typical Plasmodium falciparum presentation.,Numerous fine ring forms Double chromatin dots Marginal forms Red cells are

18、 not enlarged,A typical Plasmodium vivax presentation,Salient features are:Developing and thick(signet)ring forms Enlarged red cells,A typical Plasmodium ovale presentation,Developing form of plasmodium Comet-like red cells Enlarged red cell,A typical Plasmodium malariae presentation,Broad band form

19、 of plasmodium Red cells not enlarged,Numerous ring form of Plasmodium can be seen(as indicated by the arrows).Note size of neutrophils(for comparison).,The only definitive diagnosis that can be made from this film is that Malaria is present.Thin films would have to be examined for species identific

20、ation.,读片练习,2.Intermittent fever;arrived from India 2 months ago.,PO,PM,PV,6.New Australian previously from Malaysia.Intermittent temperatures and headaches.,PV.,PV,14.50 year old male patient presented with fever after holidaying in Viet Nam.,POT.,21.A member of the UN forces in East Timor.Presented with high temperature.,谢 谢！,