《药理检测技术》PPT课件.ppt

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1、药理检测技术,药理研究的方法实际上是利用西药药理学的方法。西药药理学的实验方法种类繁多，各有其优缺点和特殊用途，根据实验对象的性质等因素了分为以下几个方面。,(一)实验药理学方法,大致有三种形式：1对健康不麻醉动物进行主要药效学、药代动力学等观察。2.对麻醉动物进行活体解剖以研究中药对于某些器官或系统的影响；3采用离体动物器官、组织、细胞或细胞器进行“离体实验”或“试管实验”这些方法对于分析中药作用、作用部位和作用机制以及古代动力学过程均有重要意义。,(二)实验治疗学方法,这是预先用实验病理学方法使动物产生病理变化，或造成病理模型以观察中药治疗作用的一种方法。如家兔喂食含1双氢胆固醇饲料，24

2、周即可形成多发性胆固醇结石；大鼠在乙醚麻醉下剖腹，于幽门和十二指肠处结扎，19小时后取胃剖检，胃粘膜可出现多处浅表性出血性溃疡。小鼠腹腔注射10蛋黄可使血脂升高。对这些动物模型分别给予相应的中药治疗，观察其治疗效果。这种实验方法既可在整体动物（体内）进行，也可采用培养细菌、病毒、寄生虫及肿瘤细胞等方法在体外进行试验。,(三)临床药理学方法,由于种属差异，动物实验的结果不能直接搬用于人体，因此，在通过系统的动物实验取得充分资料后，还必须在人体进行观察，只有这样才能对中药作出最后的准确评价，这就是临床药理学方法。由于人体试验必须保证安全，进行人体试验的中药必须要有充分的动物实验资料或古代及民间的使

3、用经验，才能进行人体试用、随着现代科学技术的发展和应用，许多临床药理观察可在不损伤人体的情况下进行。除了采用CT、ECT、MRI等先进仪器进行整体观察以外，还可采用正常人或病人的血液、骨髓、肝活组织等样本，以及外科手术切除的人体组织或器官如子宫、肺叶等，进行体外药理试验。,(四)新技术在中药药理研究中的应用,随着药理科学的不断深入，药理研究手段逐渐由生理转变为生化或酶学手段为主了。成为分子药理学的主要内容。药理作用的观测和作用机理的探讨内容包括：（一）观测生理机能的改变。如新药对中枢神经系统产生兴奋还是抑制；对心肌收缩力或胃肠道运动是加强还是减弱；对血管或支气管是扩张还是收缩等。（二）测定生化

4、指标的变化，如血糖、电解质；生理活性物质，如血管紧张素、前列腺素、环磷苷浓度的改变等。（三）观测组织形态学变化，如血细胞大小、甲状腺大小、肾上腺皮质萎缩等,1核技术的应用,核素有放射性核素和稳定性核素二种。放射性核素可以发出射线，引起物质的电离或激发，而这种电离作用或激发作用可以用正比计数管、盖革弥勒计数管（GM计数管）、电离室、半导体探测器和闪烁计数器来测定，不论在体内或离体情况下，凡是有放射性核素存在都可以测定。核技术已较广泛地应用于中药药效学等方面的研究。通过标定中药某种有效成分，通过放射性检测可以了解其在体内的分布情况、存在形式或测定中药作用后体内某些成分含量的变化，有助于了解中药的某

5、些药理作用及作用机理等内容。,a 用于影响心血管系统中药的研究,近年国内对中药影响心肌细胞摄取放射性铷和铯进行了大量的研究工作。心肌对的摄取量很大程度上取决于心肌内毛细血管的开放数量和面积。在定条件下，心肌营养性血流量与心肌的铷和铯摄取量成正比关系。本法可用小鼠为实验动物，测定灵敏度高，特异性强，安全，操作方便，是筛选抗心绞痛药和治冠心病药的重要研究方法。,b应用放射性同位素测定免疫功能,以-胸腺嘧啶核苷酸（3H-TdR）掺入淋巴细胞转化试验测定细胞免疫功能；以51Cr标记鸡红细胞释放试验测定巨噬细胞吞噬功能；以131I白蛋白胶体颗粒、198Au胶体颗粒及32P标记的金黄色葡萄球菌等颗粒状异物

6、测定单核细胞吞噬功能。实验证明人参、黄芪、冬虫夏草、刺五加等多种中药及多种中药多糖（如银耳多糖、灵芝多糖、人参多糖、香菇多糖等）都具有增强机体免疫功能的作用。如人参皂甙能增加多种多物网状内皮系统的吞噬功能，增强对血中金黄色葡萄球菌、鸡红细胞等的吞噬廓清能力；促进小鼠IgG；、lgA、IgM的生成；促进淋巴细胞转化等。,c用于影响核苷酸中药的研究,用-乳清酸掺入可测定RNA的量，银耳多糖能使正常小鼠RNA的量增加13.6，3HTdR掺入能测定DNA的量，淫洋藿、肉苁蓉等能促进羟基脲所形成的“阳虚”动物的DNA合成增加（从5600848增加到99001660cpmmg。,d用于影响环核苷酸中药的研

7、究,环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟（cGMP）是二种具有重要生物活性的生物信息物质，不仅能传递生物信息，调节细胞代谢和机能活动，而且与多种疾病的发生发展有关。特别是近年来研究表明与免疫的调控、肿瘤的发生发展的调控都有重要关系。利用放射性标记的cAMP（-cAMP），在液体闪烁计数器上测定样品的放射性强度，可以测得用中药后对动物组织、血清或细胞内cAMP含量的影响。,e用于中医动物模型的制备,中医有虚瘀等多种临床证候。在药理研究时，用正常动物实验很难观察到中药的确实疗效，还要制备不同证候的动物模型，再用中药治疗，观察其疗效，如用60Co-r射线3.5G-y，照射小鼠全身，造成血虚模型，可使造血

8、干细胞和祖细胞数目减少，这种血虚与再障性贫血接近。,f用于中药药动学研究,应用放射性核素标记中药的有效成分来研究中药在内的吸收、分布、代谢和排泄规律，特别是研究血药浓度随时间而变化的规律，可为选择合理的给药方案、确定适宜的剂量、确定给药时间间隔、预测多次给药后体内药物的蓄积过程和可能出现的毒副作用，为有效、安全用药提供科学依据。,2 组织培养技术的应用,组织培养是指将机体的离体器官、组织和细胞等，在体外人为控制的条件下，使之继续生长、繁殖、传代、维持其生理功能的方法，从而同用于研究其在生理、病理状态下以及药物等因素对其生长、发育等生命过程的影响。在中药药理研究中，组织培养技术已有较多的应用，是

9、体外实验研究的重要方法，在很多方面可以与体内实验互相补充，并且有整体实验或一般离体实验所不能代替的优点，应用较多的有如下几个方面。,a病毒的组织培养,许多病毒株如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、腺病毒、鼻病毒、乙脑病毒，都能在组织培养中生长，如原代人胚肾单层细胞培养、原代人胚肺单层上皮细胞培养、原代人胚肌单层上皮细胞培养、鸡胚培养、原代乳兔肾上皮细胞培养等。用这些方法可以来研究中药的抗病毒作用，使用原代人胚肌皮单层细胞培养技术，从472种中药中选出抗I型单纯疱疹病毒作用最强的10种是青木香、刘寄奴、乌药、败酱草、马尾松。另外，用组织培养法还证明金樱子根、南蛇藤、一枝黄花、半枝莲等18种中药具有

10、抗病毒作用，其中金樱子根、南蛇藤和马勃有广谱抗病毒作用。,b心肌细胞培养,心肌细胞培养（鸡胚心肌组织培养、大鼠心肌组织培养、人胚心肌组织培养等）法既可用于研究中药对心肌细胞生长、发育、代谢、搏动等各种生理功能的影响，又可造成各种细胞病理模型（如代谢异常、心肌损伤、搏动节律失常等）。进行中药作用观察。是筛选对心脏作用的中药和阐明其作用机理的一个重要途径。已证明元胡、三梭、当归、土鳖虫等有不同程度地减少体外培养的心肌耗氧量的作用。,c肿瘤病细胞的培养,常用的是Hela细胞（宫颈癌细胞株）和鼻咽癌细胞株的短期体外培养，可用于筛选抗癌中药。细胞培养的方法有单层细胞培养法、细胞悬浮培养法和组织缺氧培养法

11、等。测定药物作用的方法有美蓝试管法、细胞染色法、放射性核素掺入法（-TdR掺入法等）等。利用细胞培养技术，在抗癌中药的筛选和作用机理的研究已做了大量工作。已证明防己、蛇莓、王不留行、冬凌草等对食管癌细胞有较强的杀伤作用；汉防己甲素抑制人食管癌上皮细胞的增殖。,d其它组织培养技术,体外培养的二倍体细胞仍有衰老现象，是筛选抗衰老药和衰老机制的较好模型。已证明黄芪能延长人体肺二倍体细胞自然衰老过程；黄芪还能使人胚肾细胞和地鼠及小鼠肾细胞数量增加、生长旺盛、寿命延长；三七精提物能使正常人肺上皮细胞核增大和增殖；“寿康”口服液（鹿茸、何首乌等l0余味中药制成）能显著延长大鼠、小鼠淋巴细胞寿命。应用鸡胚股

12、骨培养法、新生小鼠头盖骨-细胞培养法和鸡胚额骨分离细胞培养法，证明淫羊藿和黄芪注射液都可增加胚胎股骨的长度、重量和对的吸收量。,3 免疫学技术的应用,免疫学技术主要分为免疫化学、细胞免疫、血清学、免疫标记技术等。免疫化学技术包括各种类型免疫沉淀检测方法。如单、双向免疫扩散等各类电泳法。这些方法多用于免疫球蛋白测定、补体测定、溶菌酶测定等。细胞免疫主要有以测定T细胞为主的E玫瑰花结试验、淋巴细胞转化试验、白细胞移动抑制试验、迟发型皮肤试验二硝基氯苯（DNCB）的皮肤试验等。,应用免疫学技术，研究中药对免疫系统各个方面的影响。,提高细胞免疫：提高T细胞比值 促进淋巴细胞转化促进体液免疫：免疫球蛋白

13、IgM、lgE及 cAMP显著提高调节免疫功能：补体含量恢复正常抑制免疫功能：抑制T细胞转化,4层析法及分光光度法的应用,包括薄层色谱、气相色谱和高效液相色谱等各种色谱技术。分别可用于使用中药后体内某个化学物质或中药有效成分变化的测定。如利用CS-930TLCS仪测定使用绞股蓝以后血清中绞股蓝皂甙的含量，用日立163型气相色谱仪测定灵芝注射液消除家兔血浆羟自由基的作用；用高效液相色谱法可测定单胺类神经递质包括去甲肾上腺素（NA）。多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）等，以及这些递质的主要代谢产物如3，4-二羟甲基苯乙二醇（DHPG）。,分光光度法,可见分光光度法已广泛应用于血脂（TC、TG、

14、HDL-C、LDL-C等）成分的测定，以观察降脂药（如山楂、泽泻、当归等）的调血脂作用。也可用于尿蛋白的测定，如观察复方黄芪对大鼠血清病型肾炎尿蛋白量的影响；紫外分光光度法在中药理研究中应用也较多，如用于测定脑、肝组织中B型单胺氧化酶（MAO-B）活性，已证明白术能降低脑组织MAOB活性，而不影响肝MAOB活性，归牌汤能抑制体外大鼠肝线粒体MAOB活性；人参茎叶皂甙能提高小鼠红细胞过氧化氢酶活性；丁香叶提取物能保护邻苯三酚的老化人红细胞膜（降低白氧化速率）。用荧光光度法测定证明，首乌能降低老年鹌鹑血浆中过氧化脂质（LPO）。,5电子显微镜技术的应用,应用电子显微镜技术研究生物和人体的超微结构，

15、使人们对于组织细胞的形态结构与功能之间的关系的认识达到了新的水平。近年来，我国科研人员应用电镜技术在中药和方剂的药理作用、中医基础理论及中医临床等方面的研究工作中已做了大量的工作，在中药及方剂的药理研究中尤为突出。,6其它新技术的应用,化学发光法 用化学发光分析仪测定光子数值可反映活性氧（包括单氧、超氧阴离子、过氧化氢和羟基梓自由基OH）的综合变化。功率潜分析法 将八道脑电图机(NB82B)的信号用计算机进行积分的教学处理和频谱分析，已证明生脉散口服液能明显增加低频率段功率谱，与中枢抑制药安定类似但强度不如安定，也可说明生脉散具有镇静作用。,总 结,药理检测技术随着分子、细胞、免疫学等相关学科的快速发展，检测方法和手段也日新月异，学科之间相互渗透日益明显，生化和分子技术检测已成为主流方法，使药理检测技术发展进入了崭新的阶段。,