兴奋剂课件项翠.ppt

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1、兴奋剂的检测方法综述,漳州师范学院 2009062010 项翠,选题背景与意义,药典分析方法,检测方法,总结,展望,选题背景与意义,兴奋剂是国际上体育界对违禁药物的总称。所谓的兴奋剂实际上是指“滥用药物”，对应的英文名称是“doping”,国际奥委会公布的禁用药物种类繁多，利尿剂、-阻断剂、蛋白同化剂、麻醉剂、2-激动剂、刺激剂均在其列。2008年北京奥运会有不少于4500例的样品需要检测，因此建立一种高通量、低成本且能同时分离多种类兴奋剂的分析方法具有非常重要的现实意义。,兴奋剂问题一直是国际体坛面临的严峻挑战之一，为提高竞技能力而使用的能暂时性改变身体条件和精神状态的药物和技术。使用兴奋剂

2、不仅损害奥林匹克精神，破坏运动竞赛的公平原则，使竞技体育失去了公平竞争、催人奋发向上的本质，而且严重危害运动员的身心健康。因此，研究灵敏度高、选择性好的兴奋剂检测新方法具有十分重要的意义。,药典分析方法,磷酸可待因、盐酸普鲁卡因、盐酸丁卡因、咖啡因等中枢兴奋剂是国际奥委会禁用药物,也是不纯鸦片类毒品中的成分.在赛前运动员服用兴奋剂检测分析、在打击毒品走私和开展禁毒戒毒实际工作中,都需要对这些成分进行分析.在采用气相色谱法分析中,许多文献 报导都是用衍生化处理之后才进行分析,方法的前处理工作繁琐.而本文所采用毛细管柱气相色谱分析法不需经过任何预处理而直接进行分析和检测,故比较简便而且结果可靠。,

3、分子式 C13H20N2O2HCl 分子量 272.77药品名称 标准来源 页码 查看全文 盐酸普鲁卡因 中国药典2000年版二部 684 查看全文 盐酸普鲁卡因注射液 中国药典2000年版二部 684 查看全文 注射用盐酸普鲁卡因 中国药典2000年版二部 684 查看全文 盐酸普鲁卡因胺 中国药典2000年版二部 684 查看全文 盐酸普鲁卡因胺注射液 中国药典2000年版二部 684 查看全文,中国药典盐酸普鲁卡因的鉴别方法,药品类别：局部麻醉药性状：本品为无色的澄明的液体。药理毒理：为酯类局麻药，能暂时阻断神经纤维的传导而具有麻醉作用，对皮肤、粘膜穿透力弱，不适于表面麻醉。弥散性和通透

4、性差，其盐酸盐的结合形式在组织中释放出游离碱而发挥局部麻醉作用。对中枢神经系统常量抑制，过量兴奋。首先引起镇静、头昏，痛阈提高，继而引起眩晕、定向障碍、共济失调，中枢抑制继续加深，出现知觉迟钝、意识模糊、进而进入昏迷状态。剂量继续加大，可出现肌肉震颤、烦躁不安和惊厥等中枢兴奋的中毒症状。小剂量有兴奋交感神经的作用，使心率加快、血压上升，剂量加大，由于心肌抑制，外周血管扩张、神经节轻度阻断而血压下降，心率增快。抑制突触前膜乙酰胆碱释放，产生一定的神经肌肉阻断，可增强非去极化肌松药的作用，并直接抑制平滑肌，可解除平滑肌痉挛。药代动力学：本品进入体内吸收迅速，很快分布，维持药效约3060分钟，大部分

5、与血浆蛋白结合，并蓄积在骨骼肌、红细胞等组织内，当血浆浓度降低时再分布到全身。在血循环中大部分迅速被血浆中假性胆碱酯酶水解，生成对氨基苯甲酸和二乙氨基乙醇，前者80%以原形和结合型，后者仅有30%经肾脏排出，其余经肝酯酶水解，进一步降解后随尿排出。本品易通过血-脑屏障和胎盘。,适应症：局部麻醉药。用于浸润麻醉、阻滞麻醉、腰椎麻醉、硬 膜外麻醉及封闭疗法等。用法用量:浸润麻醉：0.25%-0.5%水溶液，每小时不得过1.5g。阻滞麻醉：1%-2%水溶液，每小时不得过1.0g。硬膜外麻醉：2%水溶液，每小时不得过0.75g。不良反应:本品可有高敏反应和过敏反应，个别病人可出现高铁血红蛋白症;剂量过

6、大，吸收速度过快或误入血管可致中毒反应。禁忌症 心肾功能不全，重症肌无力等患者禁用。注意事项:1给药前必须作皮内敏感试验，遇周围有较大红晕时应谨慎，必须分次给药，有丘肿者应作较长时间观察，每次不超过30-50mg，证明无不良反应时，方可继续给药；有明显丘肿者主诉不适者，立即停药。2除有特殊原因外，一般不必加肾上腺素，如确要加入，应在临用时即加，且高血压患者应谨慎。3药液不得注入血管内，给药时应反复抽吸，不得有回血。4本品的毒性与给药途径、注速、药液浓度、注射部位、是否加入肾上腺素等有关，应严格按照本说明书给药。营养不良、饥饿状态更易出现毒性反应，应予减量。5给予最大剂量后应休息1小时以上方准行

7、动。6脊椎麻醉时尤其需调节阻滞平面，随时观察血压和脉搏的变化。7注射器械不可用碱性物质如肥皂、煤酚皂溶液等洗涤消毒，注射部位应避免接触碘，否则会引起普鲁卡因沉淀。,检测方法,其它,广泛分布于生物界的一大类环戊稠环全氢化菲衍生物的总称，又称甾醇、甾族化合物。其分子骨架结构是由)3个六碳环己烷和1个五碳环组成的稠合四环。类固醇激素在体内的代谢过程非常复杂，因此其大部分需通过其代谢物进行测定，而所检测的样品包括血样、尿样和毛发等均具有复杂的基底干扰。因此一般的分析方法都需要包含色谱分离过程。目前，规定的合成类固醇类物质的标准分析方法是采用气相色谱-质谱（GC-MC）方法分析尿样，而液相色谱（LC-M

8、C）方法由于具有更高的灵敏度和特异性也得到了广泛的重视和长足的发展。此外，利用免疫法及电化学方法对类固醇物质进行定性和定量分析也取得了一定的进展.,类固醇,GC-MC分析,LC-MC分析,电化学方法,质谱法,其它检测方法,.类固醇兴奋剂,GC-MC分析,Marcos 等利用GC-MC/MS方法对50余种类固醇物质进行了分析，引入的外部电离的离子阱质谱在原有一级质谱的基础上大大降低了背景干扰，提高了分辨率。选择适当的碎片离子能在提高灵敏度的基础上缩短分析时间，实现在7.4min内将50余种被测物全部检出，检出限均低于0.5ng/mL。使用该方法对100余个实际尿样进行测定，得到了比较满意的结果。

9、,LC-MS分析,Mazarin等研究了同时检测糖皮质激素、2-激动剂（福莫特罗、莫达非尼、美索卡）、抗雌激素（非那雄胺、依西美坦、阿那曲唑、来曲唑、福美坦）、蛋白同化雄性类固醇（司坦唑醇、孕三烯酮、四孕三烯酮）的方法。这些兴奋剂可以经-葡萄糖苷酸酶分解后在碱性环境下用液-液萃取预处理，然后用LC-MS/MS在阳离子模式的电喷雾离子化和多重反应监测模式下进行分析，结果显示糖皮质激素、抗雌激素和类固醇的检出限可以达到(1-30 ng/mL)，激动剂的检出限可以达(100-200ng/mL)，且所有的被分析化合物的保留时间和相对丰度都有良好的重现性。该方法的突出优点是分析时间短LC-MS/MS过程

10、只需7min,费用也比传统的LC-MS/MS方法低，较适用于常规兴奋剂的检测。,电化学方法,Goyal等利用循环伏安法、示差脉冲伏安法和方波伏安法构建了对诺龙的电化学分析方法。他们使用金纳米颗粒修饰的铟锡氧化物电极，在示差脉冲伏安法下得到的线性范围为(50nmo/L-1.5mol/L)，检出限为1.3610-7mol/L；使用富勒烯修饰电极研究了诺龙的电化学行为，结果表明修饰电极与裸玻碳电极相比，对诺龙表现出更好的催化活性，利用方波伏安法得到的线性范围为（0.1nmo/L-50mol/L)，检出限为0.42 nmo/L。上述两种方法均用于对人血清中和尿液中诺龙的测定，与GC-MS测定结果有很好

11、的一致性。,其他分析方法,免疫法中最常见的是酶联免疫吸附法(ELISA)，相对于GC-MS和LC-MS方法的ELISA方法的研究还处于起步阶段，除了ELISA方法，各种免疫传感器也陆续得到应用。用免疫方法检测其他兴奋剂或兴奋剂代谢物的研究也有一些报道，如Kreuzer等报道了一种基于定量生物传感器原理检测类固醇残余物（以司坦唑醇为例）的局部表面等离子（LSPs）方法。该方法免于标记，具有较高的特异性，且与原理类似的表面等离子体共振（SPR）方法相比较，具有仪器结构简单、花费低等优势。,质谱方法,此方法是目前类固醇兴奋剂检测中通用的结构鉴定及定量测定手段。通常GC或LC与MS联用，由于涉及色谱分

12、离过程而需要耗费大量的分析时间，因此单纯利用MS本身的分离能力进行测定具有诱人的发展前景。Kosanam等验证了真空基质辅助激光解吸离子化结合线性离子阱质谱可以作为一种快速、高通量筛查兴奋剂的手段。他们考察了3种基质溶液，最终选择了在较低的质量范围（m/z100-700）内没有干扰峰的四（五氟苯基）卟啉（F20TPP）作为基质溶液，对加标尿样中(种雄性类固醇激素进行定性和定量测定，检出限和线性范围分别为0.03ng/mL和0.1-100ng/mL。这种方法不采用色谱分离即可得到比较好的检出限和线性范围，因而可作为一种快速有效的粗筛方法。,小结,雄性类固醇激素作为滥用最为广泛的一类兴奋剂，目前对

13、其进行分析和测定的方法多种多样，但从满足快速、高通量的实用性角度来看，GC和LC仍然是最普遍和通用的方法。两种方法均能够得到较高的测量精度，易于实现标准化，但均需要复杂耗时的样品预处理过程，测定灵敏度也受限于配套的检测器，因此对仪器设备要求较高。其中GC-MS能够在一次测定中得到几十种类固醇物质的信息，并且GC的分辨率优于LC，因此GC-MS方法应用得更多。而LC-MS方法不需要对样品进行衍生化，且测定灵敏度高，适合于分析一些浓度低、代谢快的物质。因此两种方法互为补充，在兴奋剂检测领域均发挥着重要作用，也是目前人们研究的热点。,利尿剂的检测方法（高效毛细管电泳法）,这类药物有氢氯噻嗪、呋赛米等

14、14种。在毛细管电泳检测利尿剂方面,Hillaert等，用单一磷酸盐(pH 7.25)缓冲溶液,10 min内线分离了氢氯噻嗪、依那普利、赖诺普利等物质,其中,氢氯噻嗪的线性范围在0.10200.400和0.0160.020 g/L。CZE-L IF法可用于测定人尿中的氨苯喋啶、呋赛米等利尿剂,方法简便快速,灵敏度高和很好的线性关系,用于实际样品分析,结果可靠。总之,HPCE作为兴奋剂检测中的一种新兴技术,在样品前处理、进样、分离摸式及检测技术不断进步的情况下,必将成为兴奋剂检测不可或缺的重要手段。,三、其它检测方法（分子光谱检测新方法）,段鸿莺考察了用分子光谱检测新方法研究了几种兴奋剂。论文

15、详细研究了几种兴奋剂的光谱性质，以荧光法和瑞利散射光谱法研究并建立了分析测定这几种兴奋剂的新方法。主要内容如下：1利用盐酸普萘洛尔的内源荧光特性建立了一种简单、快速、灵敏的分析方法。考察了溶剂、表面活性剂和酸度等对其荧光特性的影响。在最佳实验条件下，盐酸普萘洛尔的线性范围和检测限分别为1.010(-8)3.010(-6)molL和1.510(-9)molL。用于片剂及尿样中盐酸普萘洛尔的测定，获得满意的结果。2利用瑞利散射光谱和紫外-可见吸收光谱，并结合透射电子显微技术研究了盐酸普萘洛尔与纳米金的相互作用。基于盐酸普萘洛尔诱导纳米金团聚并使溶液瑞利散射光(RLS)强度显著增强的现象，提出了瑞利

16、散射光谱分析盐酸普萘洛尔的新方法。讨论了不同缓冲溶液，pH值，纳米金粒子浓度以及反应时间对体系RLS强度的影响。并考察了其它物质对此反应体系RLS强度的影响。采用固相微萃取技术处理尿样，可对盐酸普萘洛尔进行定性测定。,总结,GC-MS和LC-MS法是目前类固醇兴奋剂分析的主流方法，但这些方法由于涉及色谱分离过程而相对耗时较长，且对样品的预处理有较高的要求。目前也有许多采用其他方法（如免疫法、电化学方法以及质谱法等）分析类固醇物质的文献报道。这些方法的发展为实现类固醇兴奋剂快速、高灵敏度和高特异性的测定提供了可能。与GC相比，HPLC一般在室温条件下工作，能分离沸点高、热稳定性差、摩尔质量大的物

17、质，比较适合于分析生物和医药学上的大分子物质，如蛋白质、核酸等。对于类固醇兴奋剂的分析检测，由于经常采用尿液、血液等含有复杂基质的物质，因此用HPLC法进行分离是定量检测的前提。由于HPLC分离能力强而定性和定量检测能力有限，一般串联定性、定量和结构分析能力更强的MS检测器。LC-MS 已成为类固醇兴奋剂分析的重要手段，它很好地弥补了常用GC-MS方法的不足，可用于检测一些浓度低、代谢快的类固醇，如司坦唑醇，甚至可作为评价其他分析方法优劣的标准。,HPCE对兴奋剂检测的应用呈逐年增多的趋势。但毛细管电泳还必须解决以下关键问题:(1)兴奋剂在人的血清、唾液、尿液中的含量往往极低、且基质复杂,成为

18、制约HPCE检测灵敏度和选择性的重要因素,发展方便、快捷而准确的样品前处理尤显重要。液液萃取、固相预柱、固相微萃取等预富集技术日益受到重视。其中,固相微萃取技术集取样、萃取、富集于一身,作为样品的预处理手段,在HPCE检测兴奋剂方面有着广阔的应用前景;(2)HPCE进样量小,给低浓度样品的检测带来一定困难。电堆积技术、场放大进样、等速电泳等在线富集进样方法在一定程度上可弥补这一弱点,但方法的重现性有待提高;(3)UV检测器是HPCE最常用的检测器,但由于光程短,检测灵敏度较低,给一些低含量兴奋剂的检测带来困难。电化学方法因其不需要复杂的样品预处理和衍生过程而在环境、医药监测等方面发挥重要的作用

19、，但由于其检测通量不高，因而目前在兴奋剂检测领域还没有得到广泛的应用，只是针对一些特定的具有电活性的物质发展出相应的电化学分析方法。质谱方法是目前类固醇兴奋剂检测中通用的结构鉴定及定量测定手段。通常GC或LC与MS联用，由于涉及色谱分离过程而需要耗费大量的分析时间，因此单纯利用MS本身的分离能力进行测定具有诱人的发展前景。,随着兴奋剂检测方法的不断改进和发展，某些运动员使用兴奋剂的手段也更加隐蔽和复杂，从而给准确、快速的筛查带来一定困难。为了满足兴奋剂检测的要求，发展在线样品预处理、高通量、高灵敏度的分析方法是未来几年的必然趋势。而对现有复杂、繁琐、耗时长的样品预处理方法的改进以及新型的快速、高效、环保的样品预处理体系的发展也具有重要的实际意义。总之，兴奋剂检测技术的发展任重而道远。随着分子生物学技术的发展，新的内源性兴奋剂药物不断产生，兴奋剂检测将面临巨大的挑战。我们一方面要加快反兴奋剂检测研究的步伐，尤其需要分析化学能够提供更新的、更为有效的分析、检测手段，以维护、弘扬神圣的奥林区克精神。另一方面还应当加大力度呼吁全世界人民提高对兴奋剂危害性的认识，同时应当教育运动员人人从自我做起，拒绝使用兴奋剂，使奥运会成为干净公正的体育盛会。,展望,Thank You!,