真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核.ppt

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1、真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素,第四章 真核基因在大肠杆菌中的表达,大肠杆菌表达体系克隆基因正确表达的基本条件克隆基因表达活性的检测,真核基因的大肠杆菌表达体系,大肠杆菌表达体系 优越性：1.对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。,大肠杆菌中表达体系的不足：1.真核基因，在结构上同原核

2、基因之间存在着很大的差别。2.真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。,4.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；5.细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。,克隆基因正确表达的基本条件 最基本条件：应该能够进行正常的转录和转译，以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。重要条件：编码的蛋白质产物应能维持正常

3、的稳定性。,具有核糖体结合位点；具有克隆基因的功能（强）启动子；插入序列的正确取向。,真核基因在大肠杆菌中的表达,克隆基因表达活性的检测 1.微细胞检测法；2.巨细胞检测法；3.偶联反应测定法。,微细胞检测法：这是一种适于检测质粒基因表达的体内检测法。微细胞：指由某些细菌突变体菌株在其生长期间连续产生的一类微小的圆形的无核细胞。,通过蔗糖梯度离心将微细胞与正常细胞分开，含有质粒载体的微细胞是适于检测重组子质粒所携带的外源基因表达状况的理想体系。,Example:ColE1的衍生质粒（缺失了106dal）,在微细胞中不能合成出56103dal、42103dal、30103dal、28103dal

4、四种多肽。其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解产物。当一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片断插入到卡那霉素基因内部时，便能在微细胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2种其它的多肽分子。,巨细胞检测法 1.经紫外线照射的大肠杆菌recA uvrA细胞，DNA停止合成，而质粒载体则可以继续合成，在紫外线照射后6小时，细胞内质粒DNA的数量增加了10倍左右，在紫外线照射后的几个小时内，加入经放射性标记的氨基酸，此时合成的蛋白质绝大部分是质粒基因所编码的。,2.将含有外源基因的噬菌体重组子，感染到事先经过紫外线严格照射的大肠杆菌细胞上。由于细胞经紫外线照射使DNA受到了损伤，自身基因的表达受到了严重的抑制。通

5、过同噬菌体载体编码的蛋白质种类作比较，就可以鉴定出克隆基因编码的蛋白质产物。,偶联反应测定法 使DNA模板在细菌无细胞体系中，进行转录转译偶联反应。经过改良的这种体系中，可以使克隆在细菌质粒或噬菌体基因组上的外源片断进行体外表达，就可以比较容易的确定多肽片断是由编码模板上的哪个小片段指导合成的。,优点：1.放射性标记参入到蛋白质的效率，比体内标记法高的多，而且这个系统十分敏感。经35S标记的多肽分子，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影若干小时后可被迅速检出；2.应用这个体系，其它原核生物的基因也能够得到有效的表达。,大肠杆菌表达载体,核糖体结合位点,启动子,转录终止子,复制起点,组 成 部 分

6、 1.启动子：最佳启动子具备的条件 第一 必须是将启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上 第二 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件,第三 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。（IPTG）,2.转录终止子 启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，

7、从而提高蛋白质产物的水平。,3.转译起始序列 5-末端结构特征，决定mRNA的转译起始效率。在核糖体结合位点（RBS）的序列结构中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷残基含量的比例，诱发碱基发生定点突变；或使用转译偶联系统进行克隆基因表达,4.转译增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。5.转译终止子 mRNA转译终止必须存在终止密码子。大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率便会得到进一步的增强。,功能启动子的分离：一般程序：选用一种适当的核酸内切酶，消化切割大肠杆菌的染色体DNA，接着将切割产生的DNA限制片断群体，同一种无启动

8、子的质粒载体重组，按实验设计要求使克隆的片断恰好插入在紧邻报告基因的上游位置随后把此重组混合物转化给大肠杆菌寄主细胞，构成质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。,报告基因（reporter gene）：特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据。,利用CAT基因进行功能启动子的分离和活性测定,无启动子的CAT质粒载体,Ecoli DNA,构建

9、Ecoli基因文库,细胞裂解物、14C标记得氯霉素乙酰辅酶A,薄层层析放射自显影,CAT活性的检测：氯霉素乙酰转移酶可以催化氯霉素（2-或3-）发生乙酰化作用。,使用tetr作报告基因分离功能启动子 1.首先在大肠杆菌质粒pBR316（含有一个tet基因、Hind 位点）上的tet的启动子序列中插入一个EcoR1的酶切位点（pBRH3B,pBRH1），使之失活。2.将纯化的细菌染色体DNA片断，克隆在pBRH3B或 pBRH1 的EcoR1限制性位点上；转化给对tet敏感的大肠杆菌寄主细胞。,使用galK（半乳糖激酶基因）作报告基因分离功能启动子 能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。来源

10、于pBR322,转译终止密码子,无启动子的galK,原理：半乳糖激酶能够从ATP分子上转移一个磷酸集团给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。用同位素标记ATP，测定从ATP转移到半乳糖去的32P的放射性强度，可推算报告基因（galK）表达的半乳糖激酶的产量。,分离功能的启动子：将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1质粒载体的MCS区的单克隆位点上；将体外连接的DNA重组分子，转化给具GalE、GalK 的大肠杆菌寄主细胞，避免内源半乳糖激酶的干扰；将它们涂布在麦氏培养基（含有PH值指示剂的中性红和结晶紫，检测碳水化合物）上，筛选转化子（重组子产生红色的菌落）。,

11、pOK1质粒载体分离功能启动子的因素 1.选用的报告基因galK的编码产物半乳糖激酶，是一种易于快速定量检测的蛋白质（鉴定启动子表达活性的强弱）；2.应用麦氏培养基的显色反应特性，筛选能够利用半乳糖的转化子（分离功能启动子）。3.采用半乳糖激酶缺陷型的大肠杆菌寄主菌株（GalE+GalT+GalK）作转化受体；,常用的大肠杆菌表达载体 1.Lac启动子的表达载体 2.Trp启动子的表达载体 3.PL启动子的表达载体,理论上，凡是具有包括控制区段在内的lac操纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的特点是，含有一条足够大的编码-半乳糖苷酶的lacZ基因片断。因

12、此，每当有一个克隆的外源DNA片断插入到这个启动子之后，人保持着lacZ基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质。,1.经过Hae 切割的203bp的酶切片断上具有Lac操纵子的控制区，包括阻遏物作用区、CAP作用区以及RNA聚合酶作用区、-半乳糖苷酶的头8个密码子。有一些对阻遏物作用不敏感的启动子，也被用来制备表达载体2.95bp的Alu片断：不完整的CAP结合序列3.L8突变的203bp区段，在CAP结合序列里发生了G-A的转换4.在uv5突变，使lac启动子开始的转录显得更有效。（RNA聚合酶结合区T-A颠换,相邻碱基G-A的

13、转换）,质粒的构建：将含有lac启动子的Hae 酶切片断，经平末端连接，克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上。,增加2个碱基对,Trp启动子的表达载体 这种表达载体的优点是，它所合成的蛋白质产量高于lac启动子表达载体系统，并且是诱导型的。,构建：1.大肠杆菌染色体DNA的5.4kb Hind 片断，含有trp启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、trpE基因、trpD基因的部分序列。2.将此片断，克隆到pBR322质粒的Hind 位点，构建成了ptrpED3表达载体（含有两个Hind 位点）。3.Hind部分酶切消化，将靠近EcoR1位点的一个Hind 位点，经

14、核酸外切酶 和S1核酸酶处理，消除掉构建新的质粒载体ptrpED5-1.,使用Hind 接头，将ptrpED5-1质粒的Hinf1片断克隆到了pBR322质粒的Hind 位点上，形成重组质粒pWT111（含有trp调节序列和trpE基因的头7个密码子）。,Trp启动子表达载体已用来生产了-干扰素和-干扰素三启动子串联单元表达效率高于单启动子单元,PL启动子的表达载体 是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启动子之一。,噬菌体的阻遏物操作系统,cI基因存在一个温度敏感突变等位基因。42度时，阻遏蛋白失活；28-30度时，PL启动子完全被阻遏蛋白抑制。通过改变温度来控制PL启动子的开闭,pPLc24表

15、达载体：用来表达天然的蛋白质和融合的蛋白质。这个质粒表达载体含有MS2-聚合酶基因开始的98个密码子，不具有转译起始密码子的外源片断也能实现表达。在MS2-聚合酶基因下游，存在BamH和Hind 单切点。EcoR单切点靠近 PL启动子，处于转译起始密码子之前。,pPLa2311表达载体 可以控制具有转译起始区的外源片断插入基因的表达。这种启动子可接受热敏感的阻遏蛋白质的抑制。,组成：1.pBR322的HaeEcoR片断；编码ampr 2.噬菌体的Hae-Hae片断：PL 3.pMK20质粒的Hae片断：编码kanr 4.具有ColE1复制起点的Hae 片断：经pMK20质粒转移而来。,pPLc

16、2833表达载体 调节型强启动子：能够使克隆的真核基因在大肠杆菌寄主细胞中最有效的高水平表达。,组成：1.一个调节型的强启动子；2.一个用作选择记号的氨苄青霉素抗性基因ampr；3.一个直接位于PL启动子下游的多克隆位点（MCS）区。,若由pKN402质粒的DNA复制起点取代pPLc2833质粒的DNA复制起点，由此形成的新质粒pCP3。它在大肠杆菌寄主细胞中指导外源蛋白质合成的有效性可得到有效的提高。而且这种质粒是温度敏感型的载体。（42度，拷贝数提高510倍）,克隆的真核基因在 大肠杆菌细胞中的表达,外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位融合蛋白质的表达外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性,外

17、源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位1.细胞质中表达2.周质中表达3.胞外表达,细胞质中表达:外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成的关键因素：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分,优点：1.形成包涵体 a.蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 b.蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用 c.蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害,2.蛋白质的产量高 二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达。3.表达的质粒载体构建比较简单。,缺点：1

18、.包涵体 a.蛋白质折叠了，再折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性 b.蛋白质的终产量偏低 c.蛋白质的生产成本比较昂贵 2.还原的环境不利于二硫键的形成（硫氧还蛋白系统、谷氧还蛋白系统）,3.由于N末端存在甲硫氨酸。使蛋白质的真实性受影响4.蛋白质会被酶解5.蛋白质种类多，因此纯化比较复杂,周质中表达：周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周质。,优点：1.由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标蛋白质的纯化就比较简单 2.蛋白质酶解的程度不甚严重 3.促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧化环境

19、）4.蛋白质的N末端结构真实 在正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在体内对信号肽进行切割,缺点：1.信号肽并非总是有助于蛋白质的转运 2.有可能形成包涵体,胞外表达：使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质，分泌到胞外培养基中进行分离纯化。,途径：1.用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特别有效的程序）2.诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。（可以分离到中等产量的蛋白质）,优点：1.蛋白质的酶解作用程度低 2.由于分泌到胞外的蛋白质种类少，因此目标蛋白容易纯化 3.增进了蛋白质的折叠作用 4.蛋白质N-末端的结构真

20、实,缺点：1.在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白质，通常是不会分泌到胞外培养基中去的 2.由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释，因此目标蛋白质的纯化过程比较复杂,融合蛋白质的表达 融合基因：通常是指通过自发突变事件形成的、或是应用DNA重组技术构建的、一类具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。,由DNA体外重组构成的融合基因有两种类型 一、由报告基因的编码序列区和另一个 基因的启动子及其调节序列构成的二、由一种异源蛋白质基因的编码序列 区同寄主细胞的诱导型启动子构成,融合蛋白质：由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因，转译产生的单一的多肽序列。它们的功能往往

21、是异常的，或者是已经发生了变化。,融合蛋白质的纯化 基本原理：利用与融合蛋白质配偶体相对应的配体作为吸附剂，制备亲和层析柱，通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白质被滞留下来，其它蛋白质则流出驻外，经洗脱处理，便可回收到纯化的融合蛋白质。,融合蛋白质的切割 将其中大肠杆菌多肽组分切除掉。1.溴化氰切割法：能特异性的从甲硫氨酸残基处切割多肽链。2.胰蛋白酶切割法：能从精氨酸或是赖氨酸残基羧基一侧进行特异性的切割。3.Xa切割法：能唯一地从特异识别序列C末端切割多肽,影响克隆基因在大肠杆菌中的表达效率因素,5-UTR对克隆基因表达效率的影响 a.启动子结构对表达效率的影响 大肠杆菌启动子的

22、保守序35区（5TTGACA）和10(5TATAAT)区;它们之间的距离(17bp)。b.启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响 当mRNA分子5末端与SD序列之间的长度小于15bp时，转译效率下降。,2.质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影响 a.质粒载体点的拷贝数对表达效率的影响 b.质粒载体的不稳定性对表达效率的影响,3.mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响 a.转译起始序列对表达效率的影响 SD序列后面的4个碱基，T或A时转译作用较高，C或G时，下降50%或25%；位于起始密码子AUG上游的密码三联体的碱基，CUU或UAU时转译效率最有效，UUC、UCA或AGG时下降20

23、倍；位于起始密码子AUG下游的密码子碱基组成，也影响转译的速率。b.mRNA的稳定性对表达效率的影响,4.遗传密码子的使用对基因表达效率的影响 a.密码子使用的偏爱性现象的规律性 几乎在所有的简并密码子家族中，都有一个或两个是优先使用的偏爱性密码子；一些密码子在各种不同基因中都是最常用的（在编码脯氨酸4种同义密码子，CCC是优先使用的）高表达活性的基因比低表达活性的基因，呈现出较高程度的密码子偏爱性 简并密码子的使用频率，反应它们相应的tRNA丰度。,b.密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响 富含大肠杆菌罕用密码子的外源真核基因，很难在大肠杆菌转化子细胞中得到有效的表达。不同生物密码子的偏爱性，是阻碍外源基因在大肠杆菌中高效表达的一种重要因素。,5.寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响 培养基营养成分的选择、细胞培养方式、培养温度等环境因素能影响大肠杆菌生理状态。,