《核酸检测技术》PPT课件.ppt

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1、第2章核酸检测技术,核酸检测技术直接对动植物有害生物基因序列和结构进行测定。核酸的分离纯化PCR技术核酸杂交技术,第1节核酸的分离纯化,核酸的分离纯化的原则,保持核酸一级结构的完整性提高核酸制品的纯度,技术路线的设计,破碎细胞的方法,机械（匀浆、超声破、研磨等）,非机械（化学处理、生化法）,沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。,核酸浓度检测与完整性测定方法,浓度测定 紫外分光光度法 260nm 荧光光度法 EB荧光,完整性测定琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状；完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比

2、值,问题一：DNA样品不纯 抑制后续酶解和PCR反应,DNA提取常见问题,DNA提取常见问题,问题二：DNA降解,DNA提取常见问题,问题三：DNA提取量少,真菌,昆虫,第2节PCR扩增技术,PCR,a DNA photocopier,PCR技术简史,DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mull

3、is等因此项技术获诺贝尔化学奖,PCR技术简史,DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明,Kary B.Mullis（1944）,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,1.PCR的基础,Polymerase,Chain,Reaction,PCR,The only enzyme used in this reaction is DNA polymerase.,Polymerase,Chain,Reaction,The products of the first reaction bec

4、ome substrates of the following one,and so on.,PCR,Polymerase,Chain,Reaction,PCR,Components：Thermostable DNA Polymerase，Target DNA，Pair of Primers，dNTPs，Mg+ions，Buffer solution,Denaturation：The target DNA(template)is separated into two stands by heating to 95Primer annealing:The temperature is reduc

5、ed to around 55 to allow the primers to anneal.Polymerization(elongation,extension):The temperature is increased to 72 for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg2+.,The PCR cycle:Three different steps in each PCR cycle,PCR的扩增？,How does PCR work,How does PCR work,The third cy

6、cle,The fourth cycle,2.PCR的类型,多重PCR（multiplex PCR）巢式PCR（nested PCR）定量PCR（quantitative PCR）不对称PCR（asymmetric PCR）反向PCR（inverse PCR）逆转录PCR（reverse transcription PCR）Overlap PCR,PCR using several primer pairs SIMULTANEOUSLYTypically generates a product band for each primer pair,多重PCR（multiplex PCR）:Wha

7、t,2.1 多重PCR（multiplex PCR）,Multiplex PCR:Why,Detect several genes at onceeg.transgenic plant screenInternal controlsVERY importantTells you how well the PCR reaction workedReduces“false negatives”Reduces“false positives”,多重PCR（multiplex PCR）,Multiplex PCR:How,Same as regular PCRCare in primer design

8、Much greater chance of primer-dimersMuch greater chance of artifactsAnnealing temperatures must be close,多重PCR（multiplex PCR）,A Typical Multiplex PCR Reaction,Sterile Water 34.0 ul10X PCR Buffer 5.0 ulMgCl2(50mM)2.5 uldNTPs(10mM each)1.0 ul Primer1FWD 1.0 ul Primer1REV 1.0 ul Primer2FWD 1.0 ul Prime

9、r2REV 1.0 ul Primer3FWD 1.0 ul Primer3REV 1.0 ulDNA Polymerase 0.5 ulDNA Template 1.0 ulTotal Volume 50.0 ul,多重PCR（multiplex PCR）,Multiplex PCR:Example,Three primer pairsControl,resistance,and trait genesControl gene fragment is largest and(almost)faintestTrait gene is smallest and brightest,Resista

10、nce Gene,Trait Gene,Control Gene,Primers,多重PCR（multiplex PCR）,Multiplex PCR:Example,Three primer pairs,Resistance Gene,Trait Gene,Which are transgenic?,Control Gene,Primers,多重PCR（multiplex PCR）,Nested Multiplex PCR,2nd Stage PCR,Dilute 100 foldBetween 1st&2nd stage reactions,1F,1R,2R,3R,5R,6R,3F,2F,

11、6F,4F,5F,4R,Primary Multiplex RT-PCR,多重PCR（multiplex PCR）,2.2 定量PCR（quantitative PCR）,实时荧光定量PCR（Real time Quantitative PCR）：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。Real-time PCR monitors the fluorescence emitted during the reaction as an indicator of amplicon production at each PCR cyc

12、le(in real time)as opposed to the endpoint detection,荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。,与常规 PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,（1）定量原理,三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值,如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析,荧光定量PCR原理 扩增曲线,扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光

13、信号的收集,荧光检测元件,荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：基线期、指数增长期和平台期。,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,荧光定量PCR原理荧光域值,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,基线期,指数扩增期,平台期,荧光域值,手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段,荧光定量PCR原理Ct值,PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。,纵轴：荧光信号量,Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性,Ct值的重现性,定量原理,理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+

14、Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,扩增效率 E（amplification efficiency）一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值，其值位于0到1之间。在PCR的前20或30个循环中，E值比较恒定，为指数扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时PCR达到平台期，不再扩增。扩增效率的计算可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值与所得Ct值做图，在一定范围内应该是得到一条直线，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K为该直线斜率）即可计算出E值。,在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信

15、号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:log M=log X0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:log X0=-log(1+Ex)*Ct+log M(3)CT=-k lg X0+b（线性方程）LogX0浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。,标准曲线：CT值对DNA0作图,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。,（2）荧光定量PCR的化学原理,1.Hydrolysis probes（水解探针）(TaqMan,Bea

16、cons)2.DNA-binding(intercalating)agents（结合）(SYBR Green,Eva Green,LC Green)3.Hybridization or FRET probes（杂交）(Light Cycler),非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor,DNA产物的荧光标记,SYBR Green 法,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链D

17、NA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。信号强度与DNA分子总数目成正比。,SYBR Green,SYBR Green 法优缺点,Tm值：DNA解链一半时的温度,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),TaqMan法,TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,TaqMan法优缺点,Publi

18、shed Items in Each Year,Examples of SYBR Green real-time PCR assays for detection of plant pathogenic fungi(last 6 years),（3）定量方法,绝对定量（Absolute Quantification）确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常所说的拷贝数。相对定量（Relative Quantification）测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达的相对变化。2-C（t）双标准曲线法,相对定量中的内标 内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞

19、中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA,相对定量：参照因子Calibrator,相对定量分析方法1-Ct,相对定量分析方法2：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同,特异性 重复性 灵敏度其他问题,常见问题讨论,扩增的特异性,引物？,Tm，重新设计引物，优化条件,Tm,重复性-判断实验优劣的重要指标,判断指标：主要为标准差（SD）和变异系数（CV）影响重复性的因素：PCR 反应扩增的效率：优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率。目的基因的初始浓度：使用初始浓度具有较高数

20、量级的样本或作平行孔。标准曲线的影响：不少于5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围；理想的标准品应与样本具有高同源性，质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA。,影响灵敏度的因素,反应体系中形成的引物二聚体的影响 可以用水解探针代替SYBR Green I，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶要尽可能地优化引物设计如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。循环数 Mg2的浓度,Q1:无Ct值（信号）出

21、现,可能性不大,检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。,Q2:Ct值出现过晚（Ct38）,扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。,Q3:标准曲线的线性关系不佳,加样存在误差:使得标准品不呈梯度。标准品出现降解:

22、应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针模板中存在抑制物，或模板浓度过高。,Q4:阴性对照也出现明显的起飞,反应mix或水被污染。引物二聚体的出现：用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。反应过程中探针的降解：用PAGE电泳对探针进行检测。ROX校正的问题：如果使用了，则可能是ROX的降解所造成。,Q5:熔解曲线不止一个主峰,引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因

23、组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。,Q6:扩增效率低,反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。,两步扩增反应 Real-time qPCR:,三步扩增反应 Real-time qPCR:,3.提高PCR反应特异性的策略,巢式PCR（Nest-PCR）,四种策略,递减PCR（TouchDown PCR）,热启动PCR（HotStart PCR）,使用PCR增强剂,策略之一,巢式PCR（Nes

24、ted-PCR）,巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。,巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。,First roundprimers,First roundPCR,Second roundprimers,Second roundPCR,Gene of interest,Nested PCR:to increase specificity,策略之二,递减PCR（TouchDown PCR）,递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5的退

25、火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。,特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。,递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。,策略之三,热启动PCR（HotStart PCR）,热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度；,现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；,热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。,策略之四,使用PCR增强剂,甲酰胺，DMSO，甘油，甜

26、菜碱等都可充当PCR的增强剂。,其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。,增强剂浓度要适当,4.PCR 常见问题及分析,Denaturation TempAnnealing TempExtension TempTimeNumber of CyclesReaction Volume“Odd”Protocols,PCR Cycling Parameters,WaterBufferDNA templatePrimersNucleotidesMg+ions DNA PolymeraseExtras,Reaction Components,IMPORTANT!

27、Basic Experimental Design,A well-designed experiment can keep you from ever getting into trouble!A poorly-designed experiment is asking for problems!,Main point:Always use CONTROLSPositive controlSo youll know what a successful result looks like.Negative controlLets you know if you have contaminatio

28、n.,Experimental Design:Controls,No positive or negative controlsWhat does this result mean?,Only a positive controlHow do we know the result isnt due to contamination?,Both positive and negative controlsResults can be interpreted withconfidence.,U,U,+,U,-,+,PCR常见问题之一,无扩增产物（假阴性）,模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品

29、不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,原因,对策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间,现象：正对照有条带，而样品则无；,PCR常见问题之二,非特异性扩增,现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,PCR常见问题之二,引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多,原因,对策,重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离

30、子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数,非特异性扩增,PCR常见问题之三,拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear状态。,M 1 2,PCR常见问题之三,模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多,原因,对策,纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数,拖尾,PCR常见问题之四,假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),原因：靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物,对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消

31、毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,PCR常见问题之五-引物二聚体,5.分子检测的靶标基因,Purvis and Hector,2000,Nature,昆虫,菌物,昆虫和菌物的物种丰富度,The mitochondrial cytochrome oxidase c subunit I(COI)gene is one of the most popular markers for population genetic and phylogeographic studies across the animal kingdom.,HCOR 2198*,A

32、g1859R,mtDNA Genome,The order of genes on the mitochondrial genome,Relatively well studied at the biochemical level Size and structure conserved across all aerobic organisms Mix of variable and conserved regions Largest of the three CO subunits Broad spectrum of substitutional rates,菌物常用的靶标基因,核糖体基因包

33、括5S、5.8S、18S、28S在内的4个rDNA基因，是细胞核内染色体上的多拷贝、中度重复序列。编码18S、5.8S和28S的rDNA作为1个转录单 元，以中等重复的串联形式存在于染色体 上。,ITS作为DNA条形码的优点,（1）ITS两侧序列保守便于设计通用引物，可广泛应用于 PCR 扩增；（2）ITS的高重复度有利于从微量DNA 样品中进行检测（3）ITS可应用于同属近缘种及种内的进化关系研究；,IGS（Intergenic spacer，核糖体基因内间隔区）序列：分开每个重复序列的DNA片段。相对于ITS 区，IGS是一个高变区,它们常用于属内种间比较或种内群体比较。,beta tub

34、ulinActinRNA polymerase II large subunit,RPB1Translation elongation factor 1-Ypt1.,菌物常用的靶标基因,List of primers reported for the identification and detection of Phytophthora species known to threaten forests and other natural ecosystems.,线粒体DNA是真核生物细胞核外一种呈环状的小分子双链DNA，单拷贝，不含基因间隔区和内含子，进化历史简单明了，酶切位点少，易于分析

35、。由于mtDNA的分子进化速度比细胞核DNA快，所以mtDNA分子的分析物种种内和种间的分类灵敏度高，应用PCR等分子生物学技术可将分类单位精确到种以下，可以用来对种、变种、个体菌株及杂交种进行检测。,线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA,思考题：1.核酸沉淀常用的有机溶剂，他们的优缺点是什么。2.核酸提取不纯的原因是什么，如何改进。3.基因组提取过程中降解的原因及改进。4.1个PCR循环是有哪几步组成，分别是什么。5.不同PCR的类型，6.多重PCR如何进行，有什么优缺点7.定量PCR、扩增曲线、荧光阈值、Ct值、标准曲线、融解曲线、绝对定量、相对定量、-Ct、双标准

36、曲线法8.SYBR Green 法和TaqMan法9.Q2:Ct值出现过晚（Ct38）、阴性对照也出现明显的起飞、熔解曲线不止一个主峰的原因。10.TouchDown PCR是什么。11假阴性、非特异性扩增、拖尾、假阳性和引物二聚体出现的原因是什么，如何改进。12.COI、ITS、IGS指的是，有什么价值,第4节核酸杂交技术,核酸杂交技术,核酸杂交（hybridization）是两条互补的核苷酸单链在特定的条件下退火形成异质双链的过程。核酸杂交技术是建立在以碱基互补为基础的、以双链核酸分子在特定条件下的变性和复性为手段的，对核酸分子进行定性和定量检测的技术。,核酸杂交既可以是DNA与DNA链、

37、RNA与RNA链之间的杂交，又可以是DNA与RNA链之间的杂交。,核酸杂交可进行染色体图谱分析，测定特异DNA序列的拷贝数（甚至可检测到哺乳动物基因组中的单拷贝基因），鉴定与疾病有关的限制性片段长度多态性标记，进行基因克隆的筛选，检测不同浓度的DNA，鉴别特异基因的表达部位，,核酸探针,含有标记物的与待检测核酸片段具有高度同源性的特定核酸片段，可以对待检测核酸进行定性、定量和定位的工具。,根据核酸探针分子性质的不同可分为DNA探针和RNA探针；根据核酸探针来源的不同又分为基因组DNA探针、人工合成的寡核苷酸探针和cDNA探针。,探针的标记,放射性标记物32P、3H、35S、14C、125I、或

38、131I 非放射性标记物 地高辛(Digoxigenin,Dig)；荧光素(fluorecein)标记，如罗丹明或FITC；生物素；,Southern blotNorthern blot,斑点杂交 斑点杂交是分子杂交中最简单的一种，直接将 DNA 或 RNA 分子以斑点的形式固定在滤膜上，然后进行分子杂交。,当核酸分子的斑点面积变得更小，在单位面积滤膜上处理的样品数量就更多，当检测的灵敏度进一步提高后，就发展成 DNA 芯片。基因芯片（Gene Chip）通常指DNA芯片，其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量

39、。基因芯片的概念现已泛化到生物芯片（biochip）、微阵列（Microarray）、DNA芯片（DNA chip），甚至蛋白芯片。,基因芯片集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术、精密控制技术和激光共聚焦显微技术，使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子以及对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测分析变得切实可行。开发基因芯片的公司主要有：Affymetrix，Nanogen，BioRobotics，Caliper等。,基因芯片发展历史,Southern&Northern Blot,Dot Blot,Macroarray,Microarray,应用领域一、科研领域基因表达检

40、测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。二、生物制药领域筛选新药等 三、诊断病原体诊断，如细菌和病毒鉴定、耐药基因的鉴定。在疾病诊断方面，优生方面等,基因芯片研制的总体蓝图,表达芯片的制备检测流程,基因芯片技术以其具有高通量、快速灵敏、样品用量少等显著特点在病原菌检测中发挥着越来越重要的作用。,IF4.0,IF2.8,PCR based methods,DNA Fingerprinting,RFLP=Restriction Fragment Length PolymorphismRegular fingerprinting analyses phenotypic tra

41、its.DNA fingerprinting analyses genotypic traits.DNA fingerprinting(DNA typing)is used to characterize biological samples e.g.-In legal proceedings to identify suspects and clear others.-Paternity testing,Very simple;dependent on mutation within recognition site of restriction enzyme Former used wit

42、h southern blot experimentsEven as many restriction enzymes are known,some mutation sites do not correspond to any,-Rare endonucleases are difficult to work with,and often of a poor quality,Restriction fragment length polymorphism(RFLP),Restriction fragment length polymorphism(RFLP),Modified method:

43、Diagnostic restriction site introduced artificially by purposedly ismatched PCR primer,140,PCR based methods,Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD),RAPD is often used to show relatedness among DNA populations.In this procedure arbitrary(random)primers are used during PCR to produce a fingerprint of

44、the DNA.A single primer is used which must anneal in 2 places on the DNA template and region between the primers will be amplified.,The primers(8-10nt)are likely to anneal in many places on the template DNA and will produce a variety of sizes of amplified products.Amplified products are separated by

45、 agarose gel electrophoresis and visualized.If the samples have similar genetic make up then the pattern of bands on the gel will be similar and vice versa.This procedure is widely used to differentiate between different cultivars/varieties of the same plant.Issues to consider when using this procedure include reproducibility,quality of DNA,and several primers may have to be used.,