《核酸分离纯化》PPT课件.ppt

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1、第二节 核酸的分离纯化,主要内容,前言1 核酸分离、纯化原则1.1 保持核酸分子一级结构的完整性1.2.防止核酸的生物降解2 分离提取核酸的主要步骤2.1 细胞的破碎2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除2.3 核酸的沉淀2.4 核酸的浓度测定2.5 核酸的保存,核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。,前 言,Home,1 核酸分离、纯化原则,1.1 保持核酸分子一级结构的完整性1.1.1 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的级结构还决定其高级结构的形式以

2、及和其他生物大分子结合的方式。1.1.2 分离核酸原则：1）温度不要过高；2）控制pH值范围(pH值5-9);3）保持一定离子强度;4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.,Home,1.2 防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。,1.2.1 DNA酶抑制剂,(1）金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；(2）阴离于型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制

3、作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。,1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制剂,RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。(1)皂土（bentonite）作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。,(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大1001000倍。2）容易降解，保存在4 或液氮中；3）提RNA时，0.1%DEPC浸泡

4、器皿37 2 h。4）剧毒。,（3)肝素（4）复合硅酸盐（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-Ribonucleoside Complex,VRC),Home,(1)高速组织捣碎机捣碎(2)玻璃匀浆器匀浆(3)超声波处理法(4)液氮研磨法(5)化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）,Home,2.1 细胞的破碎,2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸

5、降解。,加入浓盐溶液（如NaCl）核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；,2.2.3 酚/氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。,(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌

6、、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。(2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。,使用酚时应注意,Home,2.3 核酸的沉淀,沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。,2.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度,当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被有机溶课剂变性。,2.3.2 有机沉淀剂,（1）乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。,（2

7、）异丙醇,优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70乙醇漂洗数次。,（3）聚乙二醇（PEG）,优点：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。,（4）精胺,精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。原理是：精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和

8、蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。,2.3.3 核酸沉淀的温度和时间,一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。,Home,2.4 核酸的浓度测定,2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量 前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 g/ml。结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA为37 g/ml；RNA为40 ug/ml。,紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤,

9、a吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。b分光光度计先用一定量的水校正零点。c测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。d计算浓度。双链DNA样品浓度(g/l)=OD260核酸稀释倍数 50/1000；RNA样品浓度(g/l)=OD260核酸稀释倍数40/1000。e分析纯度。,A：测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260mOD230应大于2.0。1)OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。2)小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残

10、存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。,测定结果分析,B：测RNA 纯的RNA样品其OD260OD280应介于之间，OD260/OD230比值应大于2.0。1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。,2.4.2 溴乙锭荧光法测定核酸的含量,原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。,Home,2.5 核酸的保存,(1)对DNA DNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存；长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2)对RNA RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 保存;长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70,可保存数年。,Home,