《外源基因的表达》PPT课件.ppt

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1、第六章 外源基因的表达,基因重组的主要目的 使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产的目的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。,基因工程技术的核心基因表达技术。基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。,基因表达在原核生物与真核生物中的差别,（1）原核生物表达系统基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录

2、成相应的mRNA;与此同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。,基因操纵子调节系统示意图,调节基因 启动基因 操纵基因 结构基因 DNA 转录（-）RNA聚合酶（+）转录 翻译 mRNA 翻译 阻遏蛋白 蛋白质 诱导剂,控制区 信息区,操纵子,（2）真核生物基因表达系统转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5和3末端后才形成成熟的、有功能的mRNA。mRNA只能在细胞质中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化，形成高级结构。,第三节 外源基因表达系统,外源基因表达系统：泛指目的基因与表达

3、载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。,外源基因表达系统,基因表达载体,受体细胞,基因表达系统,原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。,真核生物基因表达系统：如酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。,原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：,原核生物多为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚

4、。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。,一、大肠杆菌基因表达系统,大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。目前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表达的，是目前应用最广泛的基因表达系统。,大肠杆菌表达系统的优越性：,已经掌握了十分丰富的有关大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对其基因表达调控的分子机理有了深刻的了解；大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；实验已经证明，许多克隆的真核基因都可以在

5、大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达；大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。,大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：,DNA复制及重组载体的选择系统（复制子、选择标记）,外源目的基因的转录系统,蛋白质的翻译系统,1、大肠杆菌基因表达载体,（1）DNA复制及重组载体的选择系统,复制子,复制子：是一段包含复制起始位点（ori）和反式因子作用区在内的DNA片段。,大肠杆菌基因表达载体一般是质粒表达载体，含有能在大肠杆菌中有效复制的复制子。,常见的复制子,pMB1、p15A、ColE1：松弛复制型，每细胞质粒拷贝数1020个。,pSC101：严谨复制型，每细胞质粒拷贝数少于5个

6、。,在同一大肠杆菌细胞内，含同一类型复制子的不同质粒载体不能共存 含不同类型复制子的不同质粒载体可以共存,选择标记,目的：使转化体产生新的表型，将转化了的细胞从大量的菌群中分离出来。,微生物表型选择标记,显性标记,营养缺陷型标记,在基因克隆中绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号，并且主要集中在氨苄青霉素抗性、四环素抗性、链霉素抗性、氯霉素抗性以及卡那霉素抗性等少数几种抗菌素抗性记号上。其原因一方面是由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因的抗药性R因子；另一方面则是因为抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。,大肠杆菌表达载体上一般都带有一个以上的抗生素抗性基因。表达载体上的抗药性基因赋

7、予宿主特定的抗药性，使其能在抗生素的培养条件下正常生长。这样就可以筛除掉不含载体的宿主，同时保证载体在宿主中的稳定存在。在构建大肠杆菌表达载体的过程中，选择何种抗生素抗性基因，还必须考虑到是否会对特定宿主细胞的代谢活动产生影响。,（2）外源目的基因的转录系统,这一系统包括启动子、抑制物基因和终止子。启动子和终止子因宿主的不同而有差别，往往在不同的宿主中表达的效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。,启动子,启动子（promotor）：是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列，是基因表达调控的重要元件。,外源目的基因转录的起始是基因表

8、达的关键步骤。选择可调控的强启动子是构建一个理想的表达系统首先要考虑的问题。,启动子位于基因的上游，其序列的长度因生物的种类而异。当RNA聚合酶定位并结合到启动子序列上时，便可启动基因的转录。,调节基因 启动基因 结构基因 DNA RNA聚合酶 转录 mRNA 翻译 蛋白质,外源基因在强启动子的控制下容易发生转录过头的现象，形成长短不一的mRNA混合物，而过长的转录产物不仅会影响到mRNA的翻译效率,同时也会使外源基因的转录速度大大降低，从而影响目的蛋白的翻译效率。因此，在构建表达载体的时候一般采用强的启动子和强的终止子，以达到高效表达的目的。,抑制物基因,抑制物基因的产物是一种控制启动子功能

9、的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用。在适当的诱导条件下可使抑制物失活，启动子功能重新恢复。,通过抑制物基因产物可使目的基因在宿主培养到最佳状态时进行转录，从而保证转录的有效进行，特别是表达产物对宿主有害时，控制转录的时机尤其重要。理想的可调控的启动子在细胞生长的初期往往不表达或低水平表达，而当细胞增殖到一定的密度后，在某种特定的诱导因子（如光、温度或化学药物等）的诱导下，RNA聚合酶才开始启动转录，合成mRNA。,转录终止子,转录终止子（terminator）：是一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列。,转录终止子的功能：一方面，它使转录在目的基因之后立即停止，避免多余的转录以节省宿主

10、内RNA的合成底物，提高目的基因的转录量；另一方面，正常转录终止子的存在能够防止产生不必要的转录产物，有效地控制目的基因mRNA的长度，提高mRNA的稳定性，避免质粒上其它基因的异常表达。,（3）蛋白质的翻译系统,在原核生物中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合位点（SD序列）、起始密码子与SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5端非翻译序列和蛋白编码区的5端序列等。,例如：起始密码子与SD序列之间的距离：68bp，多数为7bpSD序列后面的碱基组成：为AAAA或UUUU时，翻译起始效率最高；为CCCC或GGGG是，翻译起始效率分别为最高的50%和15%。,蛋

11、白质的翻译系统,核糖体结合位点（SD序列）,翻译起始密码子,翻译终止密码子,核糖体结合位点,核糖体结合位点：是指原核基因转录起始位点下游的一段DNA序列，即Shine-Dalgarno序列（简称SD序列）。SD序列与核糖体16S rRNA特异配对而与宿主核糖体结合，它对mRNA的翻译起着决定性的作用。,核糖体与mRNA的结合程度越强，翻译的起始效率越高，而核糖体与mRNA 的结合程度主要取决于SD序列与核糖体16S rRNA碱基的互补性，因此，在构建表达载体时，要尽可能使SD序列与16S rRNA序列互补配对。,大肠杆菌SD序列的碱基组成为5 AGGAGG 3,其中以GGAG四个碱基最为重要，

12、这四个碱基中的任何一个发生突变都会引起翻译效率的大幅度下降。,翻译起始密码子,起始密码子是翻译的起始位点，通常为AUG（ATG），编码甲硫氨酸（MET），是首选的起始密码子。也有极少数生物利用其它密码子作为翻译的起始位点，如GUG、UUG等。,翻译终止密码子,翻译终止密码子与核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。在大肠杆菌中，合成多肽链的释放由RF1和RF2两个释放因子所调控，RF1识别终止密码UAA和UAG，而RF2识别终止密码UAA和UGA，由于UAA同时为两个释放因子所识别，一般被选作翻译的终止密码。,在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，通常将几个终止

13、密码串连在一起。具报道，在大肠杆菌中以四个核苷酸组成的顺式序列UAAU作为终止密码，可有效地终止多肽链的合成。,不同生物基因组甚至是同种生物不同蛋白质的基因，所用的密码子都具有一定的选择性。有的密码子在一种基因组中使用的频率高，被称为主密码子，而在另一种基因组中使用的频率较低，被称为罕用密码子。如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达水平就低。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，要考虑所表达基因的种类和性质，或对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整。,2、宿主菌,重组异

14、源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因：,大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度的微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。,为了使外源基因高效表达，必须构建作为基因表达受体菌的大肠杆菌工程菌。,常见的大肠杆菌基因表达受体菌株,3、常见的大肠杆菌表达系统（了解）,Lac和Tac表达系统：是以lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。,PL和PR表达系统：是以噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。,T7表达系统：是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的表达系统，它具有很高的表达能力。,（2）外源

15、基因在大肠杆菌表达的形式,外源基因在大肠杆菌中的表达产物：存在部位：细胞质、细胞周质或细胞外培养基中；表达形式：不溶性蛋白和可溶性蛋白两种。,包涵体蛋白,包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。,包涵体存在部位：细胞质、细胞周质,包涵体荧光图,包涵体的组成,蛋白质,非蛋白质,外源基因的表达产物：占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构象错误，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。,受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。,：包括DNA、RNA和脂多糖等。,包涵体形成的本质是细胞内

16、蛋白质的不断集聚，主要包括三个方面：,折叠状态的蛋白质的集聚作用；非折叠状态的蛋白质的集聚作用；蛋白质折叠中间体的作用。,以包涵体形式表达的外源蛋白最突出的优点是：易于分离纯化。因为包涵体的水难溶性和密度远大于其他蛋白，通过高速离心即可将包涵体蛋白与其他蛋白区分开来；对蛋白酶表现出好的抗性。,融合蛋白,融合蛋白将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。,*融合蛋白与单独表达的外源蛋白相比具有以下优点：,稳定性好；表达效率高；较易于分离纯化。,寡聚型外源蛋白,为提高外源蛋白表达量，在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连

17、在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白。,多表达单元的重组：每个表达单元都含独立的启动子、终止子、SD序列、起始密码和终止密码，形成独立转录与串连翻译的表达单元。表达的外源蛋白不需经过裂解处理。该方式适合表达相对分子质量较大的蛋白。,多顺反子重组：多拷贝外源基因有各自的SD序列、翻译起始和终止信号，但转录是在共同的转录启动子和终止子控制下进行的，表达的外源蛋白分子是相互独立的。该方式适合表达中等大小分子量的外源蛋白。,多编码序列重组：将多个外源基因串连在一起，利用同一套转录调控元件、翻译起始与终止密码子，在各编码序列的接口引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。该

18、方式特别适合表达外源小分子蛋白或多肽。,外源基因多分子线性重组的方式通常有三种：,整合型外源蛋白,为防止外源基因随质粒丢失，将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为整合型外源蛋白。,实现外源基因与宿主染色体整合是根据DNA同源交换的原理，因此在待整合的外源基因两侧必须分别组合一段与染色体DNA完全同源的序列。此外，还必须将可控的表达元件和选择标记基因连接在一起。,为获得含整合基因的重组体，被选择的载体一般是那些在受体细胞内不能自主复制或温度敏感型质粒。当外源基因被交换到染色体上后，由于宿主菌的不断分裂和增殖，细胞内的质

19、粒逐渐被稀释直至消失。外源基因整合到染色体上后虽只含有单拷贝，但在合适的条件下仍能高效表达外源蛋白。,分泌型外源蛋白,外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。,外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在N端加入1530个氨基酸组成的信号肽（signal peptides）序列。信号肽N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶所切割。,分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。简化了发酵后处理的纯化工艺。,缺点：

20、外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。,分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌后则有活性。,以分泌型蛋白的形式表达外源基因的优点：,5、在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略,高效表达外源基因须考虑的基本原则：,优化表达载体的设计。提高稀有密码子tRNA的表达作用。提高外源基因mRNA的稳定性。提高外源基因表达产物的稳定性。优化发酵过程。,二、芽孢杆菌表达系统,芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能将表达蛋白分泌到细胞外。目前常用作基因表达系统的有枯草

21、杆菌和短小芽孢杆菌等。,利用芽孢杆菌作为表达外源基因的受体菌的优点：,许多芽孢杆菌是非致病性微生物，培养条件简单，生长迅速；表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天然构相和生物学活性；某些芽孢杆菌的遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作；利用芽孢杆菌进行发酵的技术相当成熟。,1、芽孢杆菌表达载体,复制子,金色葡萄球菌的复制子：如pUB110、pC194和pE194等,短小芽孢杆菌的复制子：如pHY481和pWT481等,含金色葡萄球菌复制子的质粒表达载体在宿主细胞中拷贝数高，但不稳定，原因是质粒载体与宿主染色体DNA之间发生遗传重组。,短小芽孢杆菌型复制子的质粒表达载体在宿主细胞中的

22、拷贝数较低，但能稳定存在于宿主细胞中，甚至在没有抗生素选择压力下也不易造成质粒的丢失。,启动子,芽孢杆菌含多种转录起始识别因子（）。芽孢杆菌启动子的表达具有明显的时序性，它与菌体的生长周期和生理代谢活动密切相关。,表达载体,自主复制质粒：是一类穿梭质粒，能在大肠杆菌中复制，同时含有能在芽孢杆菌中复制的起始序列，因而也能在芽孢杆菌中进行自主复制。,整合质粒：在大肠杆菌质粒基础上构建而成，不含在芽孢杆菌进行复制的起始序列，因而不能在芽孢杆菌中自主复制，但它能插入到宿主染色体并将外源基因和标记基因整合到染色体上，随细胞染色体复制而复制，该方式表达外源基因解决了芽孢杆菌中质粒不能稳定遗传的问题。,噬菌

23、体：以芽孢杆菌温和型噬菌体构建的表达载体能将外源基因定位整合到染色体上，并且在合适条件下（温度）诱导外源基因表达。,2、宿主菌,常用的宿主菌,枯草芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,3、外源基因在芽孢杆菌中的分泌表达,芽孢杆菌的细胞膜不同与大肠杆菌，通常只有一层细胞膜，当分泌型蛋白质跨膜后就进入到培养基中，因此，外源蛋白的表达量可以达到很高的水平，其表达量可达30g/L。,4、在芽孢杆菌中高效表达外源基因的策略,提高表达质粒在细胞中的稳定性,灭活芽孢杆菌胞外蛋白酶,三、链霉菌表达系统,链霉菌是一种革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤中，能够产生多种生理活性物质。,链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所

24、具有的特点：,为非致病性细菌，不产生内毒素；可进行外源蛋白的分泌表达；可进行高密度培养，具有丰富的次级代谢途径和初、次级代谢调控体系，表达外源蛋白的时间较长；链霉菌在传统发酵工业中应用历史悠久，有良好的工业化基础。,1、链霉菌基因表达载体,启动子,结构多样，至少存在三类链霉菌基因的启动子：,与大肠杆菌基因-10区和-35区类似的启动子,仅与大肠杆菌基因-10区类似的启动子,与大肠杆菌基因-10区和-35区序列均不相同的启动子,核糖体结合位点,类似于其它原核生物的SD序列：5(A/G)GGAGG3。,终止子,具有较长的不完全互补反向重复序列，可形成发卡结构。,密码子,链霉菌对编码蛋白质的密码子具

25、有明显的偏爱性。编码蛋白质的碱基序列中GC的平均含量高达73，密码子的第一、第二和第三位碱基的GC含量分别达66、53和93，而该现象不存在于非编码区。在所有氨基酸的简并密码子中某些密码子使用频率低于2。密码子的第三位碱基具有明显的选择性，一般C的频率明显高于G的频率。,2、宿主菌,变铅青链霉菌,天蓝色链霉菌是整个链霉菌属中分子遗传学研究最清楚的菌体，但它具有较强的修饰系统。,主要有,变铅青链霉菌作为外源基因表达的受体细胞所具有的优点：遗传背景清楚，不含内源性质粒；对外源DNA无明显的修饰作用；能高效表达链霉菌基因以外的其它基因；具有高效的异源蛋白分泌系统，并且其内源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低

26、。,四、蓝藻表达系统,蓝藻又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统(PS)和光合系统(PS)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。,蓝藻与真核生物藻类最大的区别是：它无叶绿体，无真核，有70S核糖体，细胞壁中含有肽聚糖，因而对青霉素和溶菌酶十分敏感等。,1、蓝藻外源基因表达载体,穿梭质粒表达载体,基因整合平台系统供体质粒表达载体,为使外源目的基因在蓝藻细胞内能高效表达，表达载体上组装了含有不同启动子的基因表达盒,2、用作外源基因表达的宿主蓝藻,蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点：,

27、基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检测。细胞壁属G，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。,多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。,蓝藻在各生长时期均处于感受状态，均可用于转化，但通常采用对数生长中期到后期的细胞进行转化。转化过程中遮光或添加光合作用抑制剂可提高转化效率。,3、外源目的基因在蓝藻细胞中的表达,4、在蓝藻细胞中高效表达外源目的基因的策略,构建在蓝藻细胞中稳定性好的表达载体系统。组装含强启动子的外源基因表达盒。外源基因融合表达。,