《FISH杂交技术》PPT课件.ppt

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1、荧光原位杂交（FISH）Fluorescence in situ hybridization,原位杂交（ISH）,原位杂交(in situ hybridization,ISH)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。原位杂交技术(ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。,基本原理,根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的cDNA作探针，与

2、组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA)片段进行杂交，经放射自显影或非放射检测体系予以显示，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究。,原位杂交常用的标记物质,3H、35S、125I、32P等,2,荧光素、生物素、地高辛等,70年代,80年代中后期,几种原位杂交技术,1 基因组原位杂交技术2 荧光原位杂交技术3 多彩色荧光原位杂交技术4 原位PCR,荧光原位杂交,荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,它提供了将特定DNA片段和特定

3、的真核生物细胞的染色体区带联系起来的快速而有效的手段,是研究DNA序列在染色体上位置的最直接的方法,自问世以来就广泛应用于生物学研究中。它是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。,FISH发展,1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功之后,Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板,利用体外合成的含3H的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交,从而开创了RNA-DNA的同位素原位杂交技术。

4、他们都是采用放射性同位素标记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交技术不能很快得到广泛应用。,FISH发展,1974 年，Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位的准确性。1975 年,Manning 等最先在溶液的分子杂交中,使用非放射性标记,通过细胞色素C 将生物素与RNA 分子连接起来。1977 年Rudkin发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA 的非同位素原位杂交(NISH)。1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷酸探针成功地进行了染色体原位杂交,建立了非放射性原位杂交技术。至此,以荧光

5、标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。1985 年，荧光原位杂交技术被引进到植物。1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。,20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。,FISH发展,FISH原理,FISH是以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源待检的杂交体双链DNA，通过荧光标记显示出来，通过荧光显微镜

6、观察杂交信号。,荧光原位杂交特点,1.FISH不需要放射性同位素作探针标记,安全性高；2.FISH探针稳定，一次标记后可在两年内使用，经济、安全；3.实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4.FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6.既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化,也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。,FISH不需要放射性同位素作探针标记,安全性高;FISH的实验周期短,探针稳定性高;FISH能通过多次免疫化学反应,使其杂交信号明显增强,从而提高灵敏度,检测的灵敏度接近同

7、位素探针杂交；FISH的分辨率高达320Mb；FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的DNA探针,再用不同的荧光素分子检测不同的探针分子,因此可以在荧光显微镜下在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位,直接得到它们的相关位置和顺序,从而大大加速生物基因组和功能基因定位的研究。,实验流程,植物染色体常规制片,实验材料 蚕豆根尖实验目的 制备出分裂相多、杂质少、背景清晰、染色体分散且形态好的染色体标本实验步骤,取材 预处理 固定 解离（酸解）染色 压片 镜检,染色体制片,固定 固定液处理 对保持染色体完好形态很重要，并能使染色体核蛋白保持原有结构，使染色体更接近活体状态。解离 酸解或酶解 若解

8、离时间不足，细胞壁不能完全消化，染色体便无法分散、铺展;若解离时间过长，则可能导致染色体离散丢失。染色 解离后材料彻底水洗并吸干，取根尖2-3mm分生组织于载玻片上夹碎捣烂，滴加12滴染液，染色510min。压片 染色后的材料上加一些染液，盖上盖玻片，再用钝头的用具敲打，使材料分散压平，最后，覆一层吸水纸，以拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖玻片移动)，便于观察。镜检 先在低倍镜下寻找有分裂相的视野，再用高倍镜仔细观察、记数。找出染色体分散较好的中、后期细胞进行染色体计数,并准确记录其位置。,间期,在光学显微镜下，只看到均匀一致的细胞核及许多的丝状染色质。实质上间期的核是处于高度活跃的生理生化的代谢

9、阶段，正为细胞分裂准备条件。,前期,核内染色质逐渐浓缩为细长而卷曲的染色体，每一染色体含有两个染色单体，它们具有一个共同的着丝点；核仁和核膜逐渐模糊不明显。,中期,核仁、核膜逐渐消失，各染色体排列在赤道板上，纺锤丝与染色体的着丝点相连。染色体分散，易于鉴定形态、数目。,后期,各染色体着丝点分裂为二，其每条染色单体也相应地分开，并各自随着纺锤丝的收缩而移向两极，每极有一组染色体，数目和原来的相同。,末期,分开在两极的染色体各自组成新的细胞核，在细胞质中央赤道板处形成新的细胞壁，使细胞分裂为二，形成两个子细胞。这时细胞进入分裂间期。,小麦染色体制片,探针制备,所谓核酸探针即是指一段用放射性核素或其

10、他标记物(如酶与荧光素等)标记的与目的基因互补的DNA片段或单链DNA或RNA。根据其来源可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针以及PNA探针。1.cDNA探针 以mRNA为模板在逆转录酶的催化下合成一条与mRNA互补的DNA链(cDNA)用碱除去mRNA 2.基因组探针 是把染色体DNA通过超声击断或以限制性内切酶不完全水解获得许多染色体DNA随机片段择长度约15-20kb的DNA片段重组到噬菌体中经体外包装转染大肠杆菌筛选出含目的基因的大肠杆菌扩增后提取质粒 酶切分离目的基因。,3.寡核苷酸探针 为人工合成的DNA片段，一般长约20-50个bp（碱基）。可根据已知DNA或

11、RNA序列合成精确互补的DNA探针；如不知核酸序列，可依据其蛋白产物的氨基酸顺序推导出核酸序列合成DNA探针。DNA自动合成仪的出现使探针的合成十分方便。由于分子小，因此更容易渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小，限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重复序列的荧光原位杂交分析。,探针制备,4.RNA探针 制备的技术路线为：将一段含完整或部分基因的DNA片段插入重组质粒的多克隆位点，以内切酶在插入片段中某一适当部位或在插入片段下游的某一部位消化重组质粒，使之成为线性DNA，在相应的DNA依赖性RNA聚合酶催化下，以含目

12、的基因的DNA片段为模板合成RNA探针。由于RNA探针为单链，杂交时不存在第二条链的竞争，所以其敏感性较经缺口平移标记的DNA探针要高。RNA-RNA杂交分子在所有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针容易被RNase降解。,探针制备,5.肽核苷酸（PNA）探针 PNA寡聚物是一类新分子，其结构与DNA相似。但在PNA中，没有核糖-磷酸基骨架，其骨架是不带电的肽链(聚酰胺)。与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA的结合不依赖于离子强度，因此杂交时，受探针变性温度和溶液PH的影响较小，鉴于这些特点和优点，PNA有望取代DNA或RNA作为FISH的探针。但由于PNA探针只能通过化学方法进行合成，而且

13、合成费用高，因此迄今所用的PNA探针还仅限于染色体的泛着丝粒和泛端粒探针。,探针制备,PNA与DNA杂交时也遵循碱基互补配对原则,探针设计与特异性,探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键。FISH检测的准确性来源于探针的设计。FISH能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的探针。用于FISH检测的探针必须具备很高的特异性，能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片断。而且FISH的探针必须能经受原位杂交的处理而不变性。荧光基团的标记也直接影响了检测的灵敏度和原位杂交结果的检测方式。,以著名的探针生产商Vysis公司的LSI系列探针为例：LSI系列探针来源于BAC大片断基因组文库，探针所覆盖的染

14、色体片断总长可达100Kb400Kb，保证了探针的高特异性和极强的荧光信号；荧光基团采用直接标记法标记，不同波长的荧光基团使探针在荧光显微镜下呈现多种荧光信号，借此我们可以一次检测多个染色体或基因的异常；由于探针具有极强的荧光信号因而对FISH结果的检测也采用直接检测法，即在荧光显微镜下直接观察FISH的信号，而无需抗原抗体反应对荧光信号进行放大。Vysis探针的设计既确保了探针的特异性和灵敏度，同时直接的镜检也使FISH检测更简便。,探针设计,探针设计,探针类型,1、染色体单一序列探针，包括各类人工染色体探针，如酵母人工染色体、细菌人工染色体，主要用以识别染色体的易位、缺失和扩增。探针标记2

15、、染色体涂染探针，包括通过流式分选或显微切割获得的全染色体或染色体臂以及特异性区带的涂染探针，用以检测染色体数目或结构异常。3、染色体重复序列探针，主要是指着丝粒-卫星 DNA 重复序列探针和端粒重复序列探针，用以检测染色体数目异常。,染色体涂染探针：判断易位染色体,探针标记,为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。,探针标记,放射性标记：很难满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的条件，灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（32P），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低；如果使用低辐射能的放射性标记物（3H）可以得到较高分辨率，

16、但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高而难以分辨出真正信号。非放射性标记：常用的有生物素与荧光素。生物素一般通过连接到dUTP等核苷三磷酸上，这种经修饰的核苷三磷酸再通过酶促反应掺入到探针中；荧光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶作用下掺入到探针中去，常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）、羧基荧光素（FAM）、四氯-6-羧基荧光素(TET)、吲哚二羧氰（Cy3，Cy5）等,标记探针的物质,标记探针的物质：（1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin)半抗原报告分子（间接标记）间接标记：是采用生物素标记DNA探针，杂交后再用联有荧光素的抗生物素抗体检测。（可将检测信号放

17、大，监测到小至500bp的靶序列）（2）荧光物质（直接标记）直接标记：是通过荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时掺入荧光素核苷三磷酸标记探针。（检测步骤简单，但不能将信号放大，不如间接标记的探针灵敏）,探针标记,探针标记可以采用均匀标记和末端标记的方法。均匀标记有切口平移法、随机引物法和PCR扩增等方法。,对探针进行标记时，可复制合成一段新的探针分子，在复制合成过程渗入标记核苷酸，从而使整个新分子被均匀地标记。其显著的特点是标记不局限一个位点，而是均匀地渗入，探针的信号强。,均匀标记,切口平移法：先由胰DNA酶I在DNA双链上随机切口，大肠杆菌DNA聚合酶I

18、作用以切口处开始，以另一条DNA链为模板，以4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5端核苷酸和3端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记DNA链。（引物延伸法）本法与切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。由于DNA聚合必须从具有3-OH的末端开始合成，因此与切口平移不同，引物延伸法需要一段与模板序列互补的寡聚核苷酸作引物，将它与模板杂交，以提供3-OH端。,均匀标记,切口平移标记法,标记部分,切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。该方法使用时应注意：A.只能标记双链DNA 使用探针时要预先变性后再

19、使用，而且标记时DNA片段不能太小。B.DNA酶I使用的量要合适 太多会将DNA模板切碎，不能进行标记反应；太少则不能有效地打开缺口，使标记物不能进入缺口。C.标记时间不能太短 太短时间会造成标记量不足，影响杂交的进行。,均匀标记,随机引物法 原理是使被称为随机引物的6-9个核苷酸的寡核苷酸片段与单链DNA或变性的双链DNA随机互补结合（退火），以提供3-OH端，在5-3外切酶活性的DNA聚合酶大片段作用下，在3-OH端逐个加上核苷酸直至下一个引物。当反应液中含有标记的核苷酸时，即形成标记的DNA探针。引物与模板的结合以一种随机的方式发生，标记均匀跨越DNA全长。,随机引物标记法,1、不但可用

20、于双连DNA的标记，而且可用于单连DNA和RNA的标记2、操作简单3、标记率高,随机引物标记法的特点,PCR扩增 在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP，这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。用PCR聚合酶链式反应只须极少量的DNA模板（50100ng），即可扩增出大量高效标记的目的片段。若进行质粒的提取工作，需要23d完成。若直接从菌中标记目的基因，可以缩短至23h，即可获得高效率标记的探针。也可直接从具有目的基因载体质粒中扩增出目的基因，同时适用于不需提取质粒DNA迅速鉴定细菌转化的转化子。,均匀标记,PCR标记法,末端标记,直接将探针分子的某

21、个原子替换为放射性同位素原子，或直接在探针分子上加上标记的原子或复合物，这种直接标记一般是在探针分子的末端进行，所以称之为末端标记。经过末端标记的核酸分子除作为杂交探针外，更多的用于RNA S1核酸酶作图以及引物延伸反应中的标记引物。,末端标记法,实验流程,染色体显带,显带染色是将染色体经过一定程序的处理,并用特定的染料染色后,使染色体在其长轴上显示出一个个明暗交替或深浅不同的横纹,这样的横纹就叫做染色体的带。,食管癌细胞系24色染色体mFISH核型分析,每条染色体都含有一定数量、一定排列顺序、一定宽窄和染色深浅或明暗不同的带,这就构成了每条染色体的带型。显示染色体带的过程称为染色体显带。染色

22、体显带为染色体的研究提供了一个十分有效的方法。染色体的显带技术分为两大类:一类为整条染色体的显带技术；另一类为染色体局部的显带技术。,荧光原位杂交特点,1.荧光试剂和探针经济、安全；2.探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3.实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4.FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6.既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化,也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。,优点,缺点1、不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。2、必须在已知

23、探针的情况下才可进行。,一、基因定位二、物理图谱的构建三、染色体结构分析与数目测定四、物种起源、进化和亲缘关系研究五、转基因的细胞学鉴定六、基因表达分析和临床病毒学检测,荧光原位杂交的应用,Applications of FISH,基因组结构研究；染色体精细结构变异分析；病毒感染分析；人类产前诊断；肿瘤遗传学；,基因组结构研究,染色体精细结构变异分析,Viral Infections,Prenatal Diagnosis,以21号染色体的相应片段序列作探针，与外周血中的淋巴细胞或羊水细胞进行原位杂交，可快速、准确进行诊断。,FISH技术新进展,随着FISH的广泛应用，FISH本身也得到长足进步

24、。这主要表现在以下几个方面：探针 由最初的每次杂交用一种探针发展为每次杂交用多种探针，即由单色荧光原位杂交发展为多色荧光原位杂交标记物质 由单一的几种发展为现在的几十种杂交步骤和过程 分别由20多步、15h缩减为不到10步、2h,多彩色荧光原位杂交,荧光原位杂交的发展前景,FISH技术在遗传学研究中已经取得了不小的成绩，但是其深度与广度还不够，尤其与生产实践、经济效益的联系不够紧密。随着标记手段、检测试剂、荧光观察等技术的发展,FISH 技术的应用范围在不断扩展,今后该技术在研究细胞核骨架与基因表达的关系,基因转录、重排、扩增,基因组结构与调控,哺乳动物的染色体进化研究及亲缘关系等领域将会起到积极的作用。,