DNA的复制、修复与重组DNA技术.ppt

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1、第十二章 DNA的复制、修复与重组,遗传信息的传递,遗传信息的表达,分子生物学中心法则(central dogma)1958年 Crick 1970年 Temin 和 Baltimore DNA RNA 蛋白质,第一节 DNA复制的原则,半保留复制(semiconservative replication)半不连续复制(semi-discontimuous replication)RNA引物复制起始点和复制方向,一、半保留复制,定义：亲代DNA分子的两条链可以分别作为模板，按碱基互补配对原则，指导DNA新链的合成。新合成的两个子代DNA分子，碱基序列与亲代DNA分子完全一样，但一条链来自亲代D

2、NA链，另一条链是新合成的DNA链。,二、半不连续复制,定义：DNA复制时，一条链是连续复制，另一条链是不连续复制，称半不连续复制。,前导链(leading strand)：在引物的3端按5 3 方向连续不断地合成的DNA链。随从链(lagging strand)：在引物的3端按5 3 方向不连续合成的DNA链。冈崎片段（Okazaki fragment）：后随链上不连续合成的10002000或100 200个核苷酸组成的DNA小片段。,三、RNA引物,定义：DNA复制时，子链5端的一段寡聚核糖 核苷酸链，能为DNA聚合酶提供聚合新 的脱氧核糖核苷酸所需的3OH，最后 可被切除。意义：提供新的

3、脱氧核糖核苷酸聚合所需的3OH 保证复制起始部位的真实性,引物酶（RNA聚合酶）,第二节 参与DNA复制的一些酶类和蛋白质,一、原核生物大肠埃希菌的DNA聚合酶,1、DNA聚合酶（Kornberg酶）发现:1955年 Arshur.Kornberg（阿瑟.康恩伯格）1959年 诺贝尔生理和医学奖 活性:大片段 5 3聚合酶活性 和 3 5外切酶活性 小片段 5 3外切酶活性,罗杰.科恩伯格接受父亲（左）的祝贺,The Nobel Prize in Chemistry 2006for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcr

4、iption,Roger D.Kornberg,罗杰.科恩伯格,5 3外切酶活性,功能：切除RNA引物 切除突变片段，在DNA损伤修复中起作用,5 3聚合酶活性,功能：填补片段切除后的空缺,3 5外切酶活性,功能：校读功能（proof reading）意义：保证DNA复制的高度真实性,DNA聚合酶 多功能酶,Klenow片段 常用的工具酶,2、DNA聚合酶 活性：5 3聚合酶活性 3 5外切酶活性 功能：不确切,3、DNA聚合酶,组成：多亚基复和物,全酶 核心酶（）2 连接二聚体（2）单个运载夹钳复合物（2）4,功能：亚基 5 3聚合 亚基 3 5外切 亚基 连接 2亚基复合物 钳夹 亚基 钳

5、夹、滑动,特点：高续进性（50万个脱氧核糖核苷酸）高效性（1000个脱氧核糖核苷酸/秒）高保真实性（校读功能）,二、真核生物的DNA聚合酶,真核生物的DNA聚合酶：、五种功能：DNA聚合酶 聚合随从链 DNA聚合酶 聚合前导链（协同增殖细胞核抗原PCNA）DNA聚合酶 聚合线粒体DNA DNA聚合酶、校读功能、参与 DNA损伤修复,三、解链、解旋酶类和蛋白质（大肠杆菌E.coli）,1、DNA解链酶 功能：解开DNA双链 条件：需要ATP供能，2个ATP/对碱基,2、单链DNA结合蛋白 功能：维持模板单链状态 保护模板不受核酸酶水解,DNA拓扑异构酶 功能：暂时切断双链中的一股，另一股链旋转通

6、过该缺口，张力下降后，再连接缺口,DNA拓扑异构酶 功能：暂时切断双链中的两股，断端旋转，张力下降后，再连接缺口 条件：需要ATP供能,3、DNA拓扑异构酶,4、引发体,组分：DnaA 辨认并结合至复制起始部位 DnaB 解链酶作用 DnaC 帮助DnaB结合至复制起始部位 引物酶 RNA聚合酶，合成RNA引物,5、连接酶,功能：催化两段DNA链间形成3 5磷酸二酯键特点：只能催化双链DNA链上的一股或两股链的连接,第三节 DNA复制过程（大肠埃希菌）,模板：单链DNA引物：RNA引物原料：dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）聚合酶：DNA聚合酶辅助因子：Mg2其它：酶和蛋白因子

7、方向：5 3,一、复制的起始,1、复制起始部位oriC 单一：原核生物通常只有一个复制起始点 特定：高度保守序列 GATCTNTTNTTTT DnaA结合位点,DnaA:,结合至oriC的4个DnaA结合位点，形成起始复合物,作用于oriC的3个13bp序列，DNA在此处解链，形成开放型起始复合物,DnaC:,DnaB:,解开复制起始部位的DNA双链,帮助DnaB结合至复制起始部位,单链结合蛋白：,稳定并保护已解开的DNA单链,引物酶：,RNA聚合酶，合成RNA引物,维持模板单链状态,2、复制方向,双向复制,复制眼（泡）：DNA复制时，局部解开DNA的双链，在电镜下呈眼泡状突起,复制叉：DNA

8、复制时，局部DNA双链解开，在复制前进部位两侧形成的Y型或叉状结构,真核生物DNA复制,原核生物DNA复制,二、复制的延长,DNA拓扑异构酶,解旋,DNA聚合酶,催化3 5磷酸二酯键形成，聚合DNA新链,“前导链和随从链同时同方向合成”问题的解决 随从链摸板环绕,二、复制的终止,DNA聚合酶,切除引物,填补空缺,DNA连接酶,连接前后两个片段间的缺口,四、真核生物端粒DNA的复制,1、端粒：真核生物线性DNA的两个末端 结构：由数百个串联排列的GT丰富的寡聚核苷酸序列组成 人(AGGGTT)n 四膜虫(GGGGTT)n 功能：维持染色体DNA的稳定性,2、端粒酶：防止端粒缩短的一种逆转录酶 组

9、成：由RNA和蛋白质组成 蛋白质 DNA聚合酶 RNA 模板 唯一携带RNA模板的逆转录酶 功能：复制端粒序列，防止端粒缩短。,机制：,端粒、端粒酶与肿瘤：生殖细胞、干细胞：端粒酶活性保持体细胞：端粒酶活性下降，正常衰老现象恶性肿瘤细胞：端粒酶的活性恢复，使细胞永生化，形 成恶性增殖 1994年，Couter 人卵巢细胞 端粒酶表达 1997年，人端粒酶基因克隆 85%肿瘤细胞中端粒酶活性升高,第四节 DNA的损伤与修复,一、DNA损伤的因素,1、自发因素 环境中溶剂分子随即热碰撞 N-糖苷键断裂，A、G脱落,2、物理因素 紫外线 电离辐射 共价交联，嘧啶二聚体 单（双）链断裂，碱基脱落破坏，

10、分子交联，脱氧核糖破坏,3、化学因素 亚硝酸盐 C U,二、DNA损伤的类型,1、点突变 转换 同型碱基 颠换 异型碱基 调控序列 影响基因表达 编码序列 有意突变 改变蛋白质功能 无意突变 个别氨基酸改变，蛋白质功能不变 静止突变 个别碱基改变，氨基酸不变,2、缺失 一个核苷酸、一段核苷酸、一个基因 Lesch-Nyhans综合症 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）基因丢失,3、插入 一个碱基、一段核苷酸 芳香族分子等 移码突变,4、倒位,二、DNA损伤的修复机制,1、光修复机制 低等生物 解聚嘧啶二聚体 不需要光复活酶 需要光复活酶,2、切除修复机制（暗修复）所有生物 切割35磷

11、酸二酯键（扩创）、填补、连接 UV特异的核酸内切酶 着色性干皮病,AP特异的核酸内切酶,DNA聚合酶I（53外切）,P,P,P,P,O,O,O,O,5,3,DNA聚合酶I（53聚合）,3、碱基切除修复机制,DNA糖苷酶,DNA 连接酶,切割错误碱基 切割35磷酸二酯键 切除、填补 连接,DNA糖苷酶：特异识别一种DNA分子中改变的碱基，并水解该碱基与脱氧核糖间的糖苷键,形成AP位点。,AP特异的核酸内切酶：切割35磷酸二酯键,DNA聚合酶I：切除损伤链，填补缺口,连接酶：连接切口,为什么组成DNA是ATCG，而组成RNA是AUCG？,尿嘧啶-DNA糖苷酶的发现,“区分正常的尿嘧啶与胞嘧啶脱氨形

12、成的尿嘧啶”的需要,4,5,5,1,1,1,复制的真实性,1、半保留复制2、碱基互补配对原则3、RNA引物4、DNA聚合酶：校读功能5、端粒与端粒酶6、DNA的损伤修复机制7、尿嘧啶-DNA糖苷酶 DNA（T）RNA（U）,第五节 重组DNA技术,1、DNA重组：指两个DNA分子之间，或一个DNA分子的两个不同部位之间，通过链断裂和片段的交换重接，改变了基因的组合与序列。这种现象可发生在同一细胞内或细胞间，甚至不同物种的DNA分子间。2、DNA重组技术：在实验室内，用人工方法将不同来源的DNA分子拼接成一个重组(recombinant)DNA分子，并将其引入活细胞内，使其大量复制或表达，这种技

13、术称为DNA重组技术或基因工程。,3、重组DNA技术的基本步骤,（1）重组分子的构建（接）（2）引入宿主细胞（转）转化 转染 感染（3）筛选（筛）,（1）重组分子的构建（接）,目的基因或目的DNA片段的获得,聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）原理：模拟体内DNA复制 过程：94变性 58退火 72延伸 条件：DNA模板：单链DNA 寡聚核苷酸引物：按要求设计 Taq DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 辅助因子：Mg2+原料：dNTP 缓冲体系：合适的反应条件，如PH、离子强度,载体,质粒（plasmid）：细菌染色体外的双链环状DNA分子，能自主复制，有抗药性基因以便筛选。,限制性内切酶：微生物产生的，能识别双链DNA分子中某一特异碱基顺序（约4-6个碱基），并切开磷酸二酯键的酶。,+,（2）引入宿主细胞（转）,转化：将重组DNA分子，如带有外源基因的质粒，引入原核细胞，如大肠杆菌，使其在原核细胞内复制或表达。,（3）筛选（筛）,抗药性标记：四环素、氨苄青霉素、卡那霉素等,