DNA的复制和修复.ppt

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1、第十二章 DNA的复制和修复,本章重点介绍中心法则和DNA的半保留复制以及逆转录的过程和机理，对DNA的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。,知识点回顾,什么是DNA？DNA是生物遗传的主要物质基础，是遗传信息的载体。生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA 分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。,DNA的结构特征？双螺旋结构 含两条多核苷酸的双螺旋分子。Watson-Crick 模型,什么是DNA变性、复性和杂交？DNA变性 指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。DNA复性 变性DNA在适当条件下,两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，又称“退火”。杂交 DNA复

2、性过程中不同来源的DNA单链形成双螺旋结构的过程。,那么，DNA是如何参与遗传信息传递的？,中心法则,1958年Crick称之为中心法则。,DNA的生物合成：细胞内合成DNA的过程1、复制：以DNA作为模板指导的DNA合成，即将DNA携带的信息传至子代DNA。2、反转录：DNA合成也可以RNA为模扳指导合成作用，见于RNA病毒。3、修复合成：当各种因素引起DNA损伤时，损伤DNA可修复合成，校正错误，完成正确合成，以保持DNA结构 的稳定性和遗传信息的准确性。,第一节 DNA 复制 一、复制的特征（一）半保留复制两个子代分子中各有一条链来自亲代，各有另一条新合成的链，这种复制方式叫半保留复制。

3、实验证据：1957年 M.Meselson 和用大肠杆菌为材料，在含15N和14N的NH4Cl中培养证实了半保留复制方式。Cscl梯度离心的结果。,（二）复制的起始点与方向 亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移动1、复制起点：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起点。,单复制子,多复制子,（三）半不连续合成,在DNA复制过程中，一条链是连续合成的，而另一条链是不连续合成。体内仅含催化53合成的DNA聚合酶。60年代，冈琦片段的发现：合成53前导链（leading strand）是连续的，方向与复制叉一致。合成3 5随从链时，方向与叉相反，合成不连续，各片段连成一条链。,在DNA复

4、制时，1条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，可以连续复制，叫作前导链；而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能分成几个片段(冈崎片段)合成，称之为滞后链。,（四）DNA聚合反应有关的酶,Topo I和Topo II,解链酶和SSB的作用,2 引物酶合成RNA引物,3 DNA聚合酶延长子链,E.Coli的DNA聚合酶,真核生物的DNA聚合酶,DNA聚合酶水解引物并填补空隙,4 DNA连接酶 连接冈崎片段,第二节 DNA生物合成过程,DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。1解旋解链，形成复制叉：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，

5、形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。,一、复制的起始,2引发体组装和引物合成：由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域形成引发体；在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,二、复制的延长,复制的延长指在DNA聚合酶催化下，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中是DNA聚合酶。,

6、dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,DNA复制的延长过程,领头链的合成过程,随从链的合成过程,DNA聚合酶催化领头链和随从链同时合成,DNA复制过程简图,三、复制的终止,在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除；RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。,（一）去除引物，填补缺口：,在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,（二）连接冈崎片段：,随从链上不连续性片段的连接,DNA复制的

7、过程,端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。,（三）真核生物端粒的形成：,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。,端粒酶(telomerase),端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,端粒酶的分子结构,端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human tel

8、omerase reverse transcriptase,hTRT),端粒酶的组成,端粒酶(telomerase)的作用机制爬行模型,端粒酶的爬行模型（动画演示）,人的生殖细胞和癌细胞中，可以检测到端粒酶活性；而在多数的体细胞中，未检测到端粒酶活性(Kim et al,1994 Science)。在人的永生化细胞中抑制端粒酶的活性，将导致端粒缩短并最终导致细胞死亡(Herbert et al 1999 PNAS)在多数人的体细胞中，端粒随着细胞传代而渐渐缩短。将端粒酶导入到人的正常细胞中，细胞在体外至少可以多传20代(Bodnaret al,1998 Science)Werner综合症 早老

9、综合症是位于8号染色体短臂的一种DNA解旋酶基因突变,端粒在对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短的端粒（缩短的端粒其细胞复制能力受限），从而增强体外细胞的增殖能力。端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，在肿瘤中被重新激活，端粒酶可能参与恶性转化。端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。,第三节 逆转录和其他复制方式,Section 4 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,一、逆转录病毒和逆转录酶,逆转录病毒细胞内的逆转录现象：,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和

10、逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,三、滚环复制和D环复制,滚环复制(rolling circle replication)：是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,滚环复制的过程,D环复制(D-loop replication)：是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,第四节 DNA的损伤（突变）与修复,由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation

11、）。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。,一、突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础,（一）自发因素：1.自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。2.自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。3.复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。,二、引起突变的因素,胞嘧啶（C）,尿嘧啶（U）,由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引

12、起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。,（二）物理因素：,嘧啶二聚体的形成,1.脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成H。,（三）化学因素：,2.烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。3.DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。4.碱基类似物：如5-FU，6-MP等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。5.断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DN

13、A链的断裂。,三、突变的分子改变类型,DNA分子上单一碱基的改变称点突变(point mutation)。,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,血红蛋白-亚基的点突变,3.缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,4.插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,移码突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致移码突变。,缺失引起的框移突变,5.重排 DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,四、DNA损伤的修复,DNA损伤修复(repair)：是对已

14、发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态。,光修复(light repair)切除修复(excision repair)重组修复(recombination repair)SOS修复,修复的主要类型：,这是一种广泛存在的修复作用，能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。修复过程由光修复酶(photolyase)催化完成。,（一）光修复（light repair）：,光修复酶的分子结构,其修复过程为：光修复酶(photolyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物。在300600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开。光修复酶从DNA上解离。,1、形成嘧啶二聚体,2、光复合

15、酶结合于损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。切除修复机制的基本过程是将受损的DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。,（二）切除修复(excision repair)：,在原核生物中，与DNA切除修复有关的蛋白质包括UvrA、UvrB、UvrC，以及DNA pol 和DNA连接酶。UvrA和UvrB主要起辨认和结合受损部位的作用；而UvrC则主要与受损片段的切除有关。,DNA的损伤和切除修复,碱基丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA

16、聚合酶,DNA连接酶,AP核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,插入酶,碱基取代,这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。修复时，利用重组蛋白RecA的核酸酶活性，将另一股健康亲链与损伤缺口相互交换。,（三）重组修复(recombination repair),RecA的分子结构,DNA的重组修复,胸腺嘧啶二聚体,复制,核酸酶及重组蛋白,修复复制,DNA聚合酶,DNA连接酶,重组,RecA重组蛋白修复DNA示意图,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。在E.coli中，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系

17、统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,（四）SOS修复（SOS Repair）,SOS反应的机制,未诱导的细胞,靶基因,lexA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,recA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,（40个不同的位点被阻遏）,LexA(阻遏物),RecA(辅蛋白酶),引起大肠杆菌SOS反应的化合物通常对动物是致癌的。医学和分子生物学研究表明，人类癌症的发生是由于控制细胞分裂的基因发生突变。致癌物质中90%都有诱变作用，而诱变剂中90%有致癌作用。Amas 实验 利用营养缺陷型鼠伤寒沙门式杆菌。Devoret 实验,