《肿瘤标志物检验》PPT课件.ppt

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1、第十七章肿瘤标志物检验,检验教研室 郝坡,本章内容,概述肿瘤标志物的测定胚胎性抗原标志物糖类抗原标志物酶类抗原标志物激素类抗原标志物基因类标志物,第一节 概述 肿瘤标志物的发展概况 肿瘤标志物的定义 肿瘤标志物的分类 肿瘤标志物的应用,概 述,癌症对人类健康和生命的威胁很大。它和心血管疾患一起，已成为医学上的两大难关。全世界52亿人口中，每年约有700万人新患癌症，每年约有500多万人死于癌症，几乎每6秒钟就有一名癌症患者死亡。近年来，我国癌症的发病率呈上升趋势，恶性肿瘤居城市人口死因的首位。随着医学的进步和发展，诊断方法不断进步可以使大约80-90%的癌症得到确诊，而且，13的癌症患者能在早

2、期发现。世界卫生组织作出的最新权威性结论：癌症患者如果能早期发现，治愈率可达80以上。因此，早期肿瘤诊断已成为全世界医务人员长期以来极尽全力研究的热门课题。,2008年我国卫生事业发展统计公报 卫生部统计信息中心,肿瘤标志物发展概况,1845 Bence-Jones 本周蛋白1930 Zondek HCG1959 Markert 同工酶1963 Abelev AFP1965 Gold&Freeman CEA1969 Hubner&Todaro 癌基因1975 Kohler&Milstein 单克隆抗体1978 Herberman 提出肿瘤标志物概念1979 英国第7届肿瘤发生 TM被确认并应用

3、临床 生物学和医学会议1980 Koprowski CA19-91981 Bast et al CA1251981 Colcher et al CA72-41984 Kufe et al CA15-3.,诊断肿瘤有二大类方法,医学影像学方法检验诊断学、核医学方法。这里讨论的肿瘤标志物的测定，就属于这一类。,肿瘤标志物的定义,肿瘤标志物（Tumor Marker，TM）：是由肿瘤细胞产生的，存在于细胞、组织或体液中，能用化学或免疫方法定量的、能证实癌肿存在（或在某一脏器存在）的、能监测肿瘤治疗和预后的物质。这些物质必须在正常人中不存在或者是在癌肿患者中出现的水平显著高于正常人。,肿瘤标志物的分类

4、,细胞肿瘤标志物：位于细胞中的物质或抗原，如激素受体、白血病表型、分子基因等。体液肿瘤标志物：病理情况下，浓度增加时可在血液、尿液或其他体液中测得的物质，如AFP、CA19-9、CEA、CA15-3等。,肿瘤表型标志物：酶、胚胎性抗原、异位性蛋白、激素等,出现于癌细胞转化和临床进展阶段。肿瘤基因标志物：基因突变、基因表达异常等，出现于癌前起动阶段。,肿瘤标志物的分类（化学特性）,癌胚抗原类标志物 糖类抗原标记物酶类标志物激素类标志物癌基因其他,理想的肿瘤标志物的标准,特异性100%灵敏度100%器官特异性 与肿瘤大小或分期有关 能进行疗效观察 与预后有关 可靠的预测价值,然而目前所应用的肿瘤标

5、志物均未达到上述要求，但如正确合理使用，仍有很大临床价值，关键是要正确评价肿瘤标志物检测的临床意义。,肿瘤标志物的临床应用,正常人群中的筛查 有症状者的辅助诊断 癌症的临床阶段的分期 疾病进程的预后指标 评估治疗方案 判断癌症是否复发 治疗应答的监测,普 查,一般不适宜对无症状人群进行普查 以CEA普查结肠癌为例：,肿瘤标志物用于普查的五项原则,应十分清楚该肿瘤的发病率应能检测早期肿瘤该肿瘤的早期治疗比晚期治疗更经济有效测定方法的灵敏度、特异性和重复性良好普查所需费用能被接受,定 位,TM基本上不能对肿瘤定位 极少数TM如PSA，甲状腺球白等具器官特异性，但不是肿瘤特异性。,确 诊,通常不能进

6、行确诊因为TM无足够的灵敏度，不能排除假阴性结果。但本周蛋白(多发性骨瘤）、AFP（肝癌）、-HCG（绒毛膜癌）和降钙素（C-细胞癌）等有助确诊。,分 期,大多数TM与疾病分期有关，且浓度与肿瘤大小通常存在关联但并不能根据个体测得值来判断肿瘤大小，也不能以TM 浓度精确指示各期肿瘤，因为各期肿瘤的TM浓度范围极广，且互相重叠。,预 后,术前TM浓度增加，术后降低，表示这些TM对此肿瘤有预后价值。在病程监测中，TM的浓度增加或降低与疾病的预后密切相关。,TM评价治疗有效性方案（Beastall,1991),无效：TM浓度与治疗前相比下降50%有效：TM浓度与治疗前相比下降90%显效：TM浓度下降

7、至临界值以下,影响血液和体液中肿瘤标志物浓度的因素 1肿瘤的大小和肿瘤细胞的数目：肿瘤越大细胞越多，肿瘤标志物的浓度越高。2肿瘤细胞合成和分泌肿瘤标志物的速度：肿瘤细胞合成和分泌肿瘤标志物的速度越快，血液循环中肿瘤标志物的浓度越高。3肿瘤组织的血液供应好坏：若血液供应差，血液循环中肿瘤标志物的浓度低。,4肿瘤细胞是否有坏死和坏死的程度：肿瘤细胞坏死后，释放出大量肿瘤标志物，使肿瘤局部和血液中肿瘤标志物的浓度升高。5肿瘤细胞的分化程度和肿瘤的分期：肿瘤细胞分化程度越差，恶性程度越高，越晚期，产生的肿瘤标志物越多。,6肿瘤细胞是否表达和合成肿瘤标志物：有些肿瘤细胞不表达、不携带肿瘤标志物，则在血液

8、和体液中就检测不到。7肿瘤标志物在体内的降解和排泄速度：若肝、肾功能差，排泄速度慢，则肿瘤标志物在体内可异常升高。,分析前 1.标本采集对检测结果的影响:前列腺按摩、前列腺穿刺、射精、导尿和直肠镜检查后，血液PSA和PAP值可升高(宜在此操作过后一周取样）；肝、肾功能异常和胆道排泄不畅、胆汁淤滞等均可造成如CEA、ALP、GGT等浓度增高。,肿瘤标志物检测的影响因素,某些药物会影响肿瘤标志物的浓度，如抗雄激素治疗前列腺癌时可抑制PSA产生，导致PSA假阴性结果。唾液和汗液污染标本可使鳞状上皮细胞癌相关抗原（SCC）、CA 19-9浓度升高，CEA也会轻度升高。,2.标本保存对检测结果的影响:血

9、液标本采集后应及时离心，若从采血到血清分离的间隔时间60min，NSE浓度会从血小板中释放而增高；保存於4冰箱中，24小时内测定；如在23个月内测定，则应-20保存，避免反复冻融。酶类和激素类肿瘤标志物不稳定，易降解，应及时测定或低温保存。,由于红细胞和血小板中也存在神经元特异性烯醇化酶（NSE），因此，样本溶血可使血液中NSE浓度增高（RBC中有大量的NSE，1%的溶血可使血清NSE升高5ug/L)。黄疸血样本，会引起PSA的检测值升高。,分析中 1.测定方法和试剂对检测结果的影响：从方法学来看，肿瘤标志物测定方法很多，有放射免疫测定法，酶联免疫测定法，化学发光免疫测定法等，每种测定方法有自

10、己的精密度和重复性，但手工操作的方法重复性较差，误差比较大，操作时要特别认真；用自动化仪器进行测定，重复性好，误差小。,有研究报道，使用12种不同的CEA试剂盒检测某一混合血清中CEA的浓度，结果其差异超过100%。导致分析间误差的主要原因是没有测定的标准化，包括缺乏统一的抗原、抗原成分、校正品和参考方法等。因此，在工作中要尽量使用同一种方法，同一种仪器和同一厂家的试剂盒进行测定。,2.交叉污染对检测结果的影响：当测定非常高浓度标本时，交叉污染成为一个导致假阳性的潜在问题。所以应不时地复查有无标本被交叉污染。,3.嗜异性抗体对检测结果的影响：大多数肿瘤标志物的测定中常使用一对鼠单克隆抗体来与肿

11、瘤抗原反应，如果病人血清中存在嗜异性抗体（特别是人抗鼠抗体），它可能在两种鼠单克隆抗体间起“桥梁”作用，导致在无抗原的情况下，出现肿瘤标志物浓度增高的假象。,分析后：1参考值范围：不同标本如血液、尿液、胸、腹水等，必须有不同的参考值。不同地区、不同人群、不同方法、不同试剂和设备应建立自己的参考值范围。,2病人基础测定值的变化，对于结果的分析极有价值。故应监测病人治疗前、治疗中和治疗后各个阶段肿瘤标志物含量的变化，最好画一张肿瘤标志物含量的变化的曲线图，以便综合分析。,3一般病人的结果在排除检测方法引起的误差后，上升或下降25都有临床价值。对于测定结果特别异常的标本必须复查，以防测定误差。4由于

12、肿瘤标志物测定其临床意义的特殊性，必须加强与临床的交流和沟通当改变肿瘤标志物检测方法和试剂时，必须通知临床，否则会影响结果的判断。,5必须知道肿瘤标志物的半寿期（手术后降到一半所需的时间），这有助解释某些肿瘤标志物，如AFP和hCG 的浓度变化，对于临床疗效判断有重要意义。,主要肿瘤标志物经手术后半寿期,胚胎抗原类标志物,胎儿发育早期，由肝脏和卵黄囊合成的一种血清糖蛋白，电泳时位于白蛋白和1球蛋白之间，胎儿出生后不久即逐渐消失。成人血清中含量甚微。,AFP异质体,LCA结合型AFP 25，原发性肝癌 25，良性肝病,临 床 意 义,在我国6070的肝癌病人存在AFP高于正常值 正常人血清AFP

13、值为1030g/L。凡 11AFP500g/L持续1个月或AFP200g/L持续2好个月，应高度怀疑肝癌，同时应有医学影像学好的证据参与诊断低浓度（50200g/L）持续时间超过2个月的好患者，应视为肝癌的高危人群当谷丙转氨酶（ALT）正常，用AFP来诊断肝 h1癌，可取性可达100,在进行肝癌诊断时，应排除由妊娠、活动性肝炎、生殖腺胚胎癌、继发性肝癌和少数消化道肿瘤等引起的AFP升高，通常由非原发性肝癌引起的AFP升高，一般都不会高于400g/L。3.65.2的胆管上皮癌、84以上的肝母细胞癌和70左右的生殖性畸胎瘤及较少比例的胰腺癌、肺癌、肾癌和白血病患者也可出现AFP低浓度的异常升高。,

14、良性病变中的AFP升高升高一般是散在的和暂时的肝炎病人，10升高，水平50g/L；肝硬化病人，30升高，水平 500g/L；,缺 点,对原发性肝癌的敏感性只有70左右对转移性肝癌的诊断效果就更差对AFP指标阴性，临床可疑的患者应结合其他检查资料或多项指标联合检测，如同时检测-GT-、AFU、ALP等，以期优势互补，减少漏诊。,疗效观察和预后的评估,若AFP及胆红素同时明显升高，病人存活期很短原发性肝癌在治疗过程中，如AFP含量保持在术后水平，示病情稳定；下降示病情好转，持续不降说明疗效不佳,是一种可溶性糖蛋白，胚胎期主要存在于胎儿的胃肠管、胰腺和肝脏。胃肠道恶性肿瘤时可见血清CEA升高，在乳腺

15、癌、肺癌及其他恶性肿瘤中也可出现表达，并分泌于体液中。,临 床 意 义,恶性肿瘤的辅助诊断：CEA在中晚期肿瘤中的阳性率胰腺癌 8891肺癌 76结肠癌 73乳腺癌和卵巢癌 73膀胱癌、宫颈癌和子宫内膜癌中也有升高,CEA 的 优 势,CEA是一个结肠癌标记物，CEA与CA242联合应用目前被认为是对结肠癌的最佳标记物的搭配。在整个直肠癌治疗其间，CEA是一个有效的监视指标，是发现复发的理想指标，其敏感性高于X线和直肠镜。,CEA的局限性,只在肿瘤的中晚期才有较显著的升高，也不只局限于某一类肿瘤，因此CEA对多数肿瘤的早期发现与鉴别诊断并无帮助CEA具有较高的假阳性和假阴性，并不适合用于肿瘤的

16、普查,预后的评估,术前CEA水平正常的患者手术治愈率高，术后不易复发若术前CEA已升高者，则大多数已有血管壁、淋巴系统和周围神经的侵犯和转移，预后较差术后若癌症有转移或复发者，在临床症状出现前10周13个月，CEA就有可能开始升高，CEA浓度变化随病情进展而升高,伴CEA升高的良性疾病,吸烟者溃疡性结肠炎胰腺炎结肠息肉,二、糖类抗原标志物 糖类抗原标志物是由肿瘤细胞分泌的或者是肿瘤细胞表面的抗原。针对这些抗原的单克隆抗体已成为临床上较为有用的肿瘤标志物，比天然分泌的标志物（如酶和激素）更敏感。,（一）糖类抗原12-5（CA125）是卵巢癌和子宫内膜癌的肿瘤标志物分子量为20万的糖蛋白可被单克隆

17、抗体OC125所识别在卵巢肿瘤上皮和Mullerian副肾管来 源的病理和正常组织中表达，其生物 学功能不明。,糖类抗原12-5（CA125）,正常人血清中CA125的临界值为35U/ml CA125的半衰期仅4.8天，在血中很快代谢，所测即时结果能反映肿瘤近期的变化状态,CA125在卵巢癌，尤其是上皮性卵巢癌、子宫内膜癌可出现升高，还可在肺癌、宫颈癌等肿瘤状态时升高。CA125在子宫内膜异位症、1%的健康妇女、3%的患良性卵巢疾病妇女及其他非肿瘤患者也可见到升高。,CA125的临床应用,卵巢癌的辅助诊断观察病情及预测预后-血清CA125升高（或降低）2倍的患者中大于80%的病例为病情进展（或

18、消退）-CA12535U/ml的病人中有95%在第二次手术时仍有肿瘤存在早期复发的监测:75%的患者在肿瘤复发前一年左右时间CA125的水平就已升高,（二）糖类抗原19-9（CA199）CA19-9是胰腺、胃和肠癌的标记物。正常人群血清CA19-9阳性的临界值为 37U/ml,癌组织中的浓度要高于正常组织或炎性组织；是胰腺癌诊断较好的指标，还可用于胃肠癌的检测和筛选。伴有黄疸的良性疾病患者也可出现CA19-9升高，但一般不120/ml，经临床处理后可恢复到正常值范围。,CA19-9的临床应用,诊断-可以作为胰腺和胆管癌较好的标志物用于临床，胰腺癌的阳性率可达70%92%，胆管癌为66.7%-对

19、胃癌、肝癌和结直肠癌的阳性率分别可达25%60%、56%60%，18%58%,疗效监测 治疗中及术后含量下降乃至正常表示治疗方案正确。复发跟踪 升高可作为肿瘤复发转移的亚临床诊断或重要的辅助诊断指标。,CA19-9水平在胰腺癌诊断中反应参数的比较,三、酶类标志物,根据来源可分为两类：组织特异性酶：因组织损伤或变化使储存在 细胞中的酶释放（如前列腺特异性抗原）非组织特异性酶：主要是肿瘤细胞代谢强，特别是无氧酶酵解增强，大量释放入血液中（如已糖激酶）,（一）前列腺特异性抗原（PSA）,PSA是前列腺的特异性标记物属于器官特异性抗原，不具备肿瘤特异性 PSA属于酶类肿瘤标记物，具有糜蛋白酶 样和胰蛋

20、白酶的活性 PSA在正常男性含量小于4g/L,游离PSA在正常男性含量小于1g/L前列腺癌、前列腺增生、前列腺炎和前列腺损伤都会导致血清PSA升高血清 PSA在男性其他正常组织中和患其他癌肿时血清PSA都不会升高。,前列腺癌的诊断,在区别良性与恶性前列腺疾病时测定游离PSA（f-PSA）与总PSA（tPSA)的比率或复合PSA(cPSA)与tPSA的比率更有临床价值。f-PSAtPSA 大于25%：多为良性病人。f-PSAtPSA 小于10%：多为前列腺癌。cPSA在前列腺癌病人血清中的含量明显高于良性肿瘤病人,（二）神经原特异性烯醇化酶（NSE）,同功酶类肿瘤标志物，正常仅存于神经组织和红细

21、胞中正常人血清值为 13g/L小细胞肺癌、神经母细胞瘤和神经内分泌肿瘤及脑损伤时升高待测标本绝对禁止溶血，溶血可出现NSE血清水平升高,NSE的临床意义,NSE在小细胞肺癌中的阳性率明显高于对照组，NSE可作为小细胞肺癌的高特异、高灵敏的肿瘤标志物,跟踪监测癌肿病情进展和疗效判断-肺癌 NSE高于11.8 g/L预示肺癌患者生存期较短；化疗24小时后 NSE下降是治疗效果良好的标志。,其他癌症癌症复发的早期标志，尤其是存在胸腔、肝、骨骼、脑、脊髓转移NSE升高的癌症患者5年存活率仅为5%12%,NSE的临床应用,四、激素类肿瘤标志物,激素类肿瘤标志物根据分泌激素的部位不同而分为正位性激素和异位

22、性激素两类。不同类型的恶性肿瘤可分泌不同种类的异生性激素或分泌出同一种的激素，而同一种肿瘤细胞可分泌一种或多种不同的异生性激素。,人绒毛膜促性腺激素（HCG）,糖蛋白类激素，由蛋白核心与位于羧基端 的以唾液酸为终止的侧链组成两个亚基组成:&:与-LH,TSH 和 FSH相同:与-LH有交叉由合胞体滋养层细胞产生 被证实是一种原始物质(可作为一种有用的肿瘤标志物),HCG,临床应用：HCG上升：几乎所有绒毛膜上皮细胞癌、70%的非精原细胞性睾丸癌，胃肠道、肺、乳腺肿瘤时亦可见。HCG水平与肿瘤大小、疾病预后有关脑脊液中HCG上升提示肿瘤有脑转移可用于监测治疗,五、基因类标志物的测定,癌基因原癌基

23、因抑癌基因,癌基因、抑癌基因与生长因子的关系,癌基因,抑癌基因,细胞,生长因子,正调控,负调控,产物,终末分化,增 殖,癌基因所编码的产物与细胞的肿瘤性转化相关。它以显性的方式对细胞生长起阳性作用，并促进细胞增殖、转化。,一、癌基因(oncogene)指在体外能引起细胞转化，在体内能诱发肿瘤的基因。癌基因的名称一般用三个斜体小写字母表示:myc、ras、src等。,病毒癌基因(virus oncogene,v-onc)存在于病毒基因组中的一段核苷酸片段（癌基因），它不编码病毒的结构成分，对病毒复制也没有作用，但可以使细胞持续增殖、转化。如src,（一）病毒癌基因,*病毒基因组结构,如前，在该病

24、毒基因结构中，它除含有病毒复制所需的基因（如gag、pol及env）外，还含有一种特殊的转化基因即src能导致所培养的细胞转化并呈恶性表型，也能在动物中引起恶性肿瘤，这种基因被称为病毒癌基因（v-onc）。第一个被鉴定的蛋白质-是酪氨酸蛋白激酶基因，它来自 Rous Sarcoma Virus，称为src,目 录,整合到基因组中的病毒cDNA毗邻原癌基因,并表达一融合mRNA内含细胞原癌基因,后者又被包装到病毒粒子中.,（二）细胞癌基因,细胞癌基因(cellular-oncogene,c-onc)从肿瘤组织细胞中分离出的致癌的基因片段，即它是来自细胞中的致癌基因。（它由正常细胞基因组中的原癌基

25、因(proto-oncogenes,pro-onc)转化而来。,二、原癌基因1、概念：在正常细胞组织中存在的与癌基因相同相似的（高度同源）核苷酸片段。它是基因的正常版本，是癌基因的前体，这类基因的表达产物与正常细胞的生长，增殖、分化及调控等相关。,正常情况下，这些原癌基因处于静止或低表达的状态，对细胞无害，对维持细胞正常功能具有重要作用，当其被活化时，细胞发生癌变。,2、细胞原癌基因的特点.广泛存在于生物界中，从酵母到人的细胞普遍存在；.基因序列高度保守；.作用通过其产物蛋白质来体现；.某些物理、化学及感染性因等能使原癌基因激活。,它们既可以被导入逆录病毒而活化成病毒癌基因（v-onc），也可

26、因突变或异常表达而活化成细胞癌基因（c-onc）。活化的癌基因能诱导细胞的异常增殖和肿瘤发生。,3、细胞原癌基因的分类及其产物,生长因子，如sis，生长因子受体，如fms、erbB，蛋白激酶及其它信号转导组分，如src、ras、raf，与细胞周期调控相关的蛋白，如RB、P53、bcl-1转录因子，如myc、fos、jun等。,细胞外生长因子 sis-P28跨膜的生长因子受体c-src、c-abl、c-mos、c-raf细胞内信号传导体c-src、c-abl、c-ras、c-mas、H-ras、K-ras、N-ras、crk核内转录因子 myc、fos与细胞周期调控相关的蛋白，如RB、P53、b

27、cl-1,原癌基因的产物,目 录,（原癌基因）,三、抑 癌 基 因Anti-oncogenes,抑癌基因(cancer suppressive gene,anti-oncegene)抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因。在70年代广泛研究癌基因之前，通过体细胞杂交、流行病统计学及细胞遗传学分析已指出，存在能抑制细胞转化的基因表型。,（一）、抑癌基因的基本概念,关于肿瘤细胞的增生能被某种基因产物抑制的概念，首先来自体细胞杂效试验。Harris于1969年发现，正常细胞与肿瘤细胞融合所产生的杂交细胞不再具有致瘤性，提示从正常细胞来的某种基因起抑制肿瘤发生的作用。而当融合细胞丧失了含有这种特

28、殊基因痤的染色体时，则可以重现其致瘤性，从而证明该染色体携带抑癌基因。,细胞杂交试验,（二）、常见的抑癌基因,癌基因、抑癌基因与肿瘤发生,（一）获得启动子与增强子（二）基因易位、重排（三）原癌基因扩增（四）点突变（五）甲基化程度降低,出现新的表达产物 出现过量的正常表达产物出现异常、截短的表达产物,一、癌基因活化的机制,癌基因被激活的结果,二、原癌基因激活与肿瘤发生,（一）、ras 基因变异与肿瘤发生,（二）、myc 基因变异与肿瘤发生,（三）、neu 基因变异与肿瘤发生,（四）、bcl 基因变异与肿瘤发生（五）、mdm2 基因,三、抑癌基因失活与肿瘤发生,（一）视网膜母细胞瘤基因（Rb基因）

29、,Rb（人类视网膜细胞瘤）基因是第一个被克隆的抑癌基因。Rb的突变导致视网膜瘤。散发性Rb发生较晚，一般只危及一眼，遗传性Rb往往危及双眼，3岁左右发病形成多个肿瘤。在G1期Rb与E2F结合，抑制E2F的活性，在G1/S期Rb被细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2）磷酸化失活而释放出转录因子E2F，促进蛋白质的合成，使细胞周期运行。,1、Rb基因105KD、27个外显子，含25个AA残基，单链，去磷酸化为活性形式。2、Rb基因的生物学功能（1）、监控、限定细胞周期按程序进行（负调控）（2）、抑制C-myc、C、fos 的转录，负调控细胞增殖（3）、结合存在与细胞中的异常蛋白，病毒蛋白防止其使细胞

30、 转化。3、Rb基因失活与肿瘤发生,G0 G1期,S期,E-2F,DNA,mRNA,DNA,E2F是与细胞周期运行相关的转录激活因子，它可激活DNA聚合酶、二氢叶酸还原酶、胸苷酸激酶等的转录。,（二）P53蛋白基因卫士,1、P53基因与表达蛋白的结构人P53基因位于17P13.1,全长16-20kb,含有11个外显子，蛋白分子量53kD（393aa）。P53基因是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。过去一直将P53基因认为癌基因，后来证实野生型P53基因是一种抑癌基因。,2、P53蛋白的生物学功能,3、P53基因的失活与肿瘤的发生,（1）、基因卫士，监控基因的完整性，特别是阻止DNA损伤未修复就进入细胞周期，它可激活一抑癌基因P21的转录，阻止细胞进入G1S关卡点（2）、促进细胞凋亡（参与DNA 的修复性复制，一旦修复失败，启动程序性细胞死亡。）,正确应用肿瘤标志物,联合诊断动态检查和观察综合分析正常参考值的确定,