《细胞工程》PPT课件.ppt
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1、第五章 细胞工程,主要内容:,3.1 细胞工程的基础知识与基本技术3.2 植物细胞工程3.3 动物细胞工程 3.4 微生物细胞工程,细胞工程:,细胞工程是指在细胞水平上进行的遗传操作,即研究、开发、利用各类细胞的工程。人们通过科学设计与精细操作,改变细胞的遗传基础,并通过无菌操作,大量培养细胞,使其再生成细胞、组织、器官乃至完整有机体,或生产出目物质的技术。,细胞工程的分类:,根据研究操作的对象不同,细胞工程又可分为三类,即植物细胞工程;动物细胞工程;微生物细胞工程。,第一节 细胞工程的基础知识与基本技术,一、细胞工程的基础知识 细胞是细胞工程操作的主要对象。生物界有两大类细胞:原核细胞与真核
2、细胞。,原核细胞,细菌、放线菌等的细胞属于原核细胞。原核细胞体积较小,DNA环状、不与蛋白质结合而裸露于细胞质中。胞内无膜系构造的细胞器。胞外由肽聚糖组成细胞壁,是细胞融合的主要障碍。原核细胞生长迅速,无蛋白质结合的DNA,易于人工遗传操作,是细胞改造的良好材料。,真核细胞,酵母、动物、植物等的细胞属于真核细胞。真核细胞体积较大、内有细胞核和众多膜系构造的细胞器。植物细胞有以纤维素和半纤维素为主要成分的细胞壁。真菌细胞壁主要由各种葡聚糖构成网状纤维物,还有甘露聚糖、蛋白质和脂质填充其中。真核细胞一般都有明显的细胞周期,处于有丝分裂时期的染色体呈现高螺旋紧缩状态,既不利于基因外钓,也难于插入外源
3、基因。,二、基本实验操作技术,(一)无菌操作技术 细胞工程的实验操作需要在无菌条件下进行,稍有疏忽都可能引致污染,导致实验失败。无菌室要定期用紫外线或化学试剂消毒,实验前后还应各消毒一次。无菌室外有间缓冲室,实验人员在此换鞋、更衣、戴帽,做好准备后方可进入无菌室。应注意周围环境的卫生整洁。超净工作台是最基本的实验设备,能满足较高的无菌要求。对生物材料要进行彻底消毒与除菌,实验所用器械、器皿和药品都应进行灭菌或除菌。,(二)细胞培养技术,细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。不同细胞的培养条件差异较大,但细胞培养过程有共同之处。,(三)细胞融合技术,两个或多个细胞相互接
4、触后,其细胞膜发生分子重排,导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。,第二节 植物细胞工程,(一)植物组织培养的历史 植物组织培养 是在离体人工调控的条件下,培养、研究植物细胞、组织、器官,进而分化、发育形成完整植株的技术。,20世纪初,德国植物学家Haberlandt就曾预言“植物细胞具全能性”。但由于技术上的限制,离体培养细胞未能分裂。不久之后,Hanning成功地培育出能正常发育的萝卜和辣根菜的胚,成为植物组织培养的鼻祖。20世纪30年代,植物组织培养取得了长足的进展。我国植物生理学创始人之一李继侗、罗宗洛和罗士伟相继发现银杏胚乳和幼嫩桑叶的提取液能分别促进离体银杏胚和玉米
5、根的生长,据此证明维生素和其他有机物是培养基中不可缺少的重要组成成分。,1934年美国人White以西红柿根为材料,建立了第一个能无限生长的植物组织组培物。1956年Miller发现了激动素,并指出激动素能强有力地诱导组织培养中的愈伤组织分化出幼芽。这是植物组织培养中的一项重要进展。1958年Steward顺利地从胡萝卜的细胞培养中分化长出了胚状体乃至整株。从此以后,通过组织培养方法培育完整植株的探索便在世界范围内蓬勃开展。现在已有600多种植物能够借助组织培养的手段进行快速繁殖,多种具有重要经济价值的粮食作物、蔬菜、花卉、果树、药用植物等实现了大规模的工业化、商品化生产。我国的植物组织培养工
6、作起步较迟,但已经在多个方面取得了巨大成绩。,植物细胞工程,1、定义:,生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性。,2、原理:,生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质,都有发育成为完整个体所必需的全部基因,从理论上讲,生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。,3、差异:,(1)受精卵的全能性最高,4、潜在全能性的原因:,基因表达的选择性,(2)受精卵分化后的细胞中,体细胞的 全能性比生殖细胞的低。,一、细胞的全能性,已分化的植物细胞可以发育成一个植物体,二、植物组织培养,概念科学研究表明,处于离体状态的植物活细胞,在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下,就可能表现出
7、全能性,发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程,就是植物组织培养。,二、植物组织培养,植物组织培养过程,二、植物组织培养,植物组织培养,(1)选择合适的外植体,外植体是指能被诱导产生无性增殖系的器官或组织切段,如一个芽,一段茎。选择外植体一般以幼嫩的组织或器官为宜,外植体的选择、外植体的去分化及再分化的最适条件都需进行摸索,他人成功的经验可供借鉴,并无快捷方式可循。,(2)灭菌,选择外观健康的外植体,尽可能除净外植体表面的各种微生物是成功进行植物组织培养的前提。消毒剂的选择和处理时间的长短与外植体对所用试剂的敏感性密切相关。通常幼嫩材料处理时间比成熟材料要短些。,植物组织培养的培养基 定义
8、:含有一定营养成分,供培养植物生长的基质 包括:矿质元素(大量元素和微量元素)碳源:蔗糖 琼脂:凝固剂 植物激素:生长素,细胞分裂素 维生素和有机添加物 条件:适宜的温度、PH、无菌,切取,接种,二、植物组织培养,植物组织培养过程,2、诱导去分化阶段,组织培养的第一步就是让外植体去分化,使各细胞重新处于旺盛有丝分裂的分生状态,培养基中一般应添加较高浓度的生长素类激素。去分化阶段为植物细胞依赖培养基中的有机物等进行的异养生长,原则上无需光照。但通常还是置于人工照明条件下培养,以期得到绿色愈伤组织。固体培养简便易行、占地面积小、可在培养室中多层培养。但外植体营养吸收不均、气体及有害物质排换不畅,愈
9、伤组织易出现极化现象。液体培养中,培养材料营养吸收及与环境的物质交换便捷,但需提供振荡设备,投资较大,且一旦染菌则难以挽回。,愈伤组织:离体的植物器官、组织或细胞,在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞(细胞排列疏松而无规则、高度液泡化、无定形)。,二、植物组织培养,植物组织培养过程,3、继代增殖阶段,愈伤组织长出后经过46周的迅速细胞分裂与增殖,原有培养基中的水分及营养成分多已耗失,细胞的有害代谢物已在培养基中积累,因此必须进行移植,即继代增殖。同时,通过移植,愈伤组织的细胞数大大扩增,有利于下阶段收获更多的胚状体或小苗。,二、植物组织培养,植物组织培养过程,4、生根发芽阶段,
10、愈伤组织只有经过再分化才能形成胚状体,继而长成小植株。胚状体 是指在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造。,试管苗,试管苗大规模培养,二、植物组织培养,植物组织培养过程,5、移栽成活阶段,生长于人工照明玻璃瓶中的小苗,要适时移栽到室外以利生长。此时的小苗十分幼嫩,移植应在能保证适度的光、温、湿条件下进行。在人工气候室中锻炼一段时间(称为炼苗)能大大提高幼苗的成活率。,移 栽,再分化形成的试管苗移栽到土壤中,可以发育成完整的植物体,2、植物组织培养,再分化,脱分化,愈伤组织,外植体,试管苗,植株,无菌环境下操作,细胞分裂素、生长素,细胞分裂素、生长素,固体蔗糖,细胞分裂素/生长素浓
11、度比值高,容易生芽细胞分裂素/生长素浓度比值低,容易生根,细胞培养图片,细胞培养图片,培养室,三、植物体细胞杂交,人类对自然界的认识总是不断地经历由表及里、由浅入深的发展过程。面对五彩缤纷的大干世界,人们往往不满足于自然界的种种恩赐。历史上曾有不少有识之士提出过,在不同物种间进行杂交,以期获得具有双方优良性状的杂种生物的美好设想。然而常规的杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示,逐渐将眼光转向细胞融合,试图用这种崭新的手段冲破自然界的禁锢。,1、定义:,用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞,且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。,2、
12、优势:(与有性杂交方法比较),打破了不同种生物间的生殖隔离限制,大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。,三、植物体细胞杂交,1960年该领域终于出现了重大突破。由英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶,成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体,开辟了原生质体融合研究的新阶段。植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞。这时细胞外仅由细胞膜包裹,呈圆形,要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。此外在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体叫原生质球或球状体。它们都是进行原生质体融合的好材料。,1973年Keller提出的高钙高pH法。第二年加拿大籍华人高国楠首创
13、聚乙二醇法(PEG)诱导原生质体融合;1977年他又把聚乙二醇法与高钙高pH法结合,显著提高了原生质体的融合率。次年,Melchers用 此法获得了番茄与马铃薯细胞融合的杂种。1979年Senda发明了以电激法提高原生质体融合率的新方法。由于这一系列方法的提出和建立,促使原生质体融合实验蓬蓬勃勃开展起来。,(一)原生质体的制备,取材与除菌酶解处理分离洗涤鉴定。,融合体,杂种细胞,去壁的常用方法:,酶解法(纤维素酶、果胶酶等),原生质体融合方法:,物理法:离心、振动、电刺激等,化学法:聚乙二醇(PEG),三、植物体细胞杂交,过程:,三、植物体细胞杂交,过程示意图,(三)杂合体的鉴别与筛选,双亲本
14、原生质体经融合处理后产生的杂合细胞,一般要经含有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养(液体或固体),再生出细胞壁后转移到合适的培养基中。待长出愈伤组织再按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。在此过程中可对是否为杂合细胞或植株进行鉴别与筛选。,1、杂合细胞的显微镜鉴别2、互补法筛选杂合细胞 3、采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 4、根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别,白菜,甘蓝,白菜甘蓝,三、植物体细胞杂交,植物体细胞杂交应用,二、植物细胞培养和次生代谢物的生产,植物细胞次生代谢物质来源丰富 植物细胞在生理生化过程中会产生数量极为可观的次生代谢物质。目前已发现的植物天然代谢物已超过2万种
15、,而且还在以每年新发现1600种的速度递增。我们祖先在与疾病的抗争中已积累了丰富的利用植物中的生物活性物质治病强身的经验。李时珍(1593)编篆的巨著本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物。目前约25的法定药品来自植物。然而植物生长缓慢,自然灾害频繁。即使是大规模人工栽培仍然不能从根本上满足人类对经济植物日益增长的需求,案例,紫杉醇(Paclitaxel)是继阿霉素和铂类抗癌药之后本世纪后期最受人们重视的一种抗癌新药,是一新发现的有丝分裂抑制剂,其作用机理在于阻止微管正常生理聚集,抑制癌细胞的有丝分裂和纺锤体的形成,从而使癌细胞的复制受到阻断而凋亡。1967年美国化学家Wall和Wan
16、i等首先从太平洋紫 杉(短叶红豆杉,Taxus.brevifolia)树皮中提取出来。该药于1990年进入期临床试验,1992年底获美国FDA批准上市。,紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮、叶及茎中,其中树皮中的含量最高,大约从12000株成年紫杉树中才能提取1KG的紫杉醇,而且紫杉的生长周期很长,在世界分布很少。紫杉醇的国际市场价格为450美元/g,日本有关组织从红豆杉中诱导产生愈伤组织,筛选得到细胞培养4周就增殖了5倍,紫杉醇的含量达到了0.05,比树皮中紫杉醇的含量高达10倍。Ketchum从6种紫杉醇属植物中进行愈伤组织的诱导,获得了产生紫杉醇的高产细胞株,在悬浮培养下,细胞内的紫杉醇含量
17、超过了20mg/L。清华大学化工系生物化工研究所通过固液两步培养法可以在4周内获得20g/L干物质,利用代谢调控技术在23天内将紫杉醇的含量提高到0.063%左右。,2、利用植物细胞培养生产天然色素典型案例紫草宁,紫草宁可用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药物,同时又因为其漂亮的紫红色而作为高级色素使用。紫草宁产生于亚洲的多年生 植物紫草的根部。但紫草资源严重不足,在日本,紫草已濒临灭绝,在我国,紫草(Arnebia euchroma)列入了国际二级保护植物,紫草的人工栽培成活率低,而且直接提取紫草宁的无法满足市场需求。化学合成紫草宁的工艺非常复杂,且最终产率只有0.7,生产成本昂贵。紫草宁在国际市
18、场上售价高达7000美元/kg,1974年Tabata等就研究了用于培养紫草细胞的培养基。11981年Tabata和Fujita等又用大的培养容器进行细胞悬浮培养并获 得了紫草宁衍生物。日本在1983年进行紫草细胞大规模培养来生产紫草宁。我 国南京大学等从1986年开始对该项目进行研究,在进行大量的研究之后得出,在适当的条件下,培养的紫草细胞悬浮物中紫草宁含量占干重的14%,比紫草根中 的含量高10倍。,二、植物组织培养,植物组织培养应用举例(二),五、人工种子的研制,人工种子 即人为制造的种子,它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。1978年植物组织培养学家Mur
19、alshige在第四届国际植物组织细胞培养大会上提出的设想。他认为科学已经发展到了这样的水平,科学家可以超越自然界的限制,用很少的外植体同步培育出许许多多的胚状体。将这些胚状体包埋在某种胶囊内使其具有种子的功能,并可直接用于田间播种。20世纪80年代初、美、日、法等国竞相掀起人工种子研制的热潮。我国虽然起步较迟,但人工种子的研究已被列入高技术发展计划,在胡萝卜、黄连、芹菜、苜蓿等植物中获得大量体细胞胚,人工种子在无菌条件下的萌发率已达 90以上。,二、植物组织培养,植物组织培养应用举例(三),人工种子,(一)人工种子的构成及特点,1、人工种子的结构 人工种子是21世纪极具发展潜力和经济价值的高
20、科技成果,由以下三部分构成(图3-4):,人工种皮 是包裹在人工种子最外层的胶质化合物薄膜。这层薄膜既能允许内外气体交换畅通,又能防止人工胚乳中水分及各类营养物质的渗漏,还应具备一定的机械抗压力。人工胚乳 是人工配制的保证胚状体生长发育需要的营养物质,一般以生成胚状体的培养基为主要成分,再根据人们的需要外加一定量的植物激素、抗生素、农药以及除草剂等物质,尽可能提供胚状体正常萌发生长所需的条件。胚状体 胚状体是由组织培养产生的具有胚芽、胚根等类似天然种子胚的结构,并具有萌发长成植株的能力。,2、人工种子的特点,人工种子的优点:可以不受环境因素制约,一年四季进行工厂化生产;由于胚状体是经人工无性繁
21、育产生,因此有利于保存该种系的优良性状;与试管苗相比,人工种子成本更低,更适合于机械化田间播种;可根据需要在人工胚乳中添加适量的营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等,以利于胚状体的健康生长。,人工种子的缺点:,虽然人工种子的研制历经二十几年已经取得了长足的进展,但是仍有一些关键技术尚未攻克。人工种皮的性能尚不尽人意;还未找到一种符合多数物种需要的人工胚乳;胚状体如何让它处于健康的休眠状态;人工种子怎样做到既延长其保存时间又不明显降低萌发率等。不过有理由相信,不久的将来,人类终将摆脱大自然的羁绊,实现工厂化生产植物种子的目标。,植物组织培养技术的应用,种皮,胚乳,胚状体,第三节 动物细胞工程,动
22、物细胞工程 是细胞工程的一个重要分支,它主要从细胞生物学和分子生物学的层次,根据人类的需要,一方面深入探索、改造生物遗传种性,另一方面应用工程技术的手段,大量培养细胞或动物本身,以期收获细胞或其代谢产物以及可供利用的动物。,(1)细胞培养细胞(包括单个细胞)在体外条件下的生长称为细胞培养。在细胞培养中,细胞不再形成组织。,(2)贴壁依赖性细胞或培养物由他们繁衍出来的细胞或培养物只有贴附于不定化学作用的物体(如玻璃或塑料等无活性物体)的表面时,才能生长、生存或维持其功能。,3细胞传代培养方法:,分离细胞培养物:从温箱中取出瓶壁上铺满单层细胞的培养瓶,倒掉其中剩余的培养液,先用Hanks液洗二次,
23、加入胰酶(或EDTA)消化液,放入37C温箱(有的细胞可以不放),时间可由几十秒至十几分钟,要根据细胞种类而定。,代:细胞以一个培养瓶移至另一个培养瓶,由此培养液有所稀释,即称为“一代”。,(12)传代无论是否稀释,将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养(13)原代培养以直接取自生物体细胞组织或器官开始的培养,(五)培养物的长期保存,培养物的长期保存方法基本上有两大类:经典传代法和冷冻保存法。1、经典传代法 Carrel是经典传代法的创始人之一和杰出代表,他在极简陋的条件下每隔几天把鸡胚心肌细胞传代一次。在令人难以置信的长达34年的时间里成功地无菌传代3400次。经典传
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