《真核基因表达调控》PPT课件.ppt

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1、第12章 真核生物基因表达调控,一.真核生物基因表达调控的特点,1.真核生物基因组结构特点,（1）结构庞大,（2）单顺反子,单顺反子(monocistron)即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条多肽链。,（3）重复序列,（4）基因不连续性,1）与DNA、染色体水平的变化有关,2.真核基因表达调控的特点,(1)染色质结构对基因表达的调控作用,(2)DNA拓朴结构变化 天然双链DNA几乎均以负性超螺旋构象存在。当基因激活后，则转录区前方的DNA拓朴结构变为正性超螺旋，有利于RNA聚合酶向前移动，进行转录。,(3)DNA甲基化 甲基化影响DNA与蛋白质的相互作用。(4)染色体结构的

2、变化 组蛋白发生修饰，碱基暴露等原因而引起核小体结构改变，使核小体不稳定性增加。,2）有RNA聚合酶对mRNA转录的调节 真核生物有3种RNA聚合酶：RNA pol、。每种RNA聚合酶有约10个亚基组成，其中TATA盒结合蛋白（TBP）为3种酶共有。RNA pol对催化mRNA的生成起主要作用。转录前RNA pol必须与TBP、TFD等各种通用转录因子形成转录前复合体（PIC），从而激活或抑制RNA的转录。,3）正性调节占主导 真核基因一般都处于阻遏状态，RNA聚合酶对启动子的亲和力很低。通过利用各种转录因子正性激活RNA聚合酶是真核基因调控的主要机制。采用正性调节机制更有效、经济、特异；采用

3、负性调节不经济4）转录和翻译过程分开进行 转录与翻译过程分别存在于不同的亚细胞部位（胞核与胞浆），可分别进行调控。,5)真核基因表达调控能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现预定的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。,二.真核生物基因表达调控的不同层次,真核生物与原核生物的调控差异,在细胞分裂间期的细胞核中，染色质的形态不均匀。根据其形态及染色特点可分为常染色质和异染色质两种类型。常染色质：折叠疏松、凝缩程度低，处于伸展状态，碱性染料染色时着色浅。异染色质：折叠压缩程度高，处于凝集状态，经碱性染料染色着色深。1）结构异染色质：

4、各类细胞在整个细胞周期内都处于凝集状态，多位于着丝粒区、端粒区等含有大量高度重复序列的DNA处。2）兼性异染色质：只在一定的发育阶段或生理条件下由常染色质凝聚而成。真核基因的活跃转录是在常染色质上进行,1.异染色质化对基因活化的影响,三.染色体水平的调控,异染色质（核内深染部分）和常染色质（核内浅染部分）,电镜观察细胞分裂间期中染色质情况,异染色质的紧密压缩堆积，可使调控蛋白和转录因子都不能靠近DNA，而使基因组中相当大的一部分基因处于休眠状态，其中有些基因可以从休眠变成激活，另一些则不能转变。如哺乳类雌体细胞2条X染色体，到间期一条变成异染色质者，这条X染色体上的基因就全部失活。由此可见，紧

5、密的染色质结构阻止基因表达。,1）染色体结构复杂 由DNA、组蛋白、非组蛋白等大分子组成。核小体是染色质的基本单位。,2.组蛋白对基因活性的影响,染色质结构,组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽了DNA分子，妨碍了转录，可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用；进行活跃基因转录的染色质区段常有富含赖氨酸的组蛋白（H1组蛋白）水平降低、H2A、H2B组蛋白二聚体不稳定性增加、组蛋白乙酰化（acetylation）和泛素化（obiquitination）、以及H3组蛋白巯基活化等现象，这些都是核小体不稳定或解体的因素；,早期体外实验观察到组蛋白与DNA结合阻止DNA

6、上基因的转录，去除组蛋白基因又能够转录。转录活跃的区域也常缺乏核小体的结构 核小体的结构消除或改变，会使DNA结构由右旋变为左旋，导致结构基因暴露，促使转录因子与启动区结合，诱发转录。这些都表明核小体结构影响基因转录。染色体重塑实验发现，组蛋白H1比核心组蛋白（H2A H2B H3 H4）阻遏转录作用强。染色质中的非组蛋白成分具有组织细胞特异性，可能消除组蛋白的阻遏，起到特异性的去阻遏促转录作用。,1）组蛋白对基因活性的影响,（1）染色质重塑(chromatin remodeling),在启动子区域，由于结合了组蛋白，染色质处于非活性状态，只有解除对转录模板的限制才能启动基因的表达，染色质中与

7、转录相关的结构变化称为染色质重塑;染色质重塑涉及许多蛋白复合物，可与核小体互作，影响核小体结构或改变核小体与DNA结合位置；染色质重塑复合物中的许多蛋白质对基因的转录起始非常重要，可与转录调控因子互作，或协助转录因子一起发挥作用。如：SWI/SNF复合物。,酵母交换型转换/蔗糖不发酵复合物(Yeast mating-type switching/sucrose non-fermenting,SWI/SNF复合体)首次在酵母中鉴定，并在酵母、果蝇和哺乳动物中具有保守性。SWI/SNF复合体是一个分子量为2103 kDa，含有多个亚单位的DNA依赖性ATP酶，它能够利用ATP水解产生的能量动员核小

8、体,使染色质重构,从而调节靶基因的转录。SWI/SNF复合体与基因活化和细胞增殖的多个调控因子密切相关，这些调控因子包括糖皮质激素受体、雌激素受体和Rb、C-myc原癌基因和HpvE1蛋白能各自与SWI/SNF复合体相互作用并发挥功能，进一步支持了该复合体参与细胞生长调控。,The SWI/SNF Complex in Saccharomyces cerevisiae,越来越多的研究证实了SWI/SNF复合体在肿瘤发生中的作用,它的几个亚单位具有内在的肿瘤抑制子活性。染色质重塑复合物在肿瘤发生、发育,核受体所介导的激素应答,DNA复制、修复和重组等方面也扮演着重要的角色。,染色质修饰复合物类型

9、：,ATP依赖的染色质改构复合物(ATP-dependent chromatin remodeling complex)利用水解ATP获得的能量,改变组蛋白与DNA之间的相互作用对组蛋白进行共价修饰的组蛋白修饰酶复合物(Histone-modifying complex)对组蛋白的尾部进行共价修饰,包括赖氨酸的乙酰化,赖氨酸和精氨酸的甲基化,丝氨酸和苏氨酸的磷酸化,赖氨酸的泛素化等,破坏核小体之间以及组蛋白尾部与基因组DNA之间的相互作用,引起染色质的重塑,重塑因子调节基因表达机制的假设:1)1 个转录因子独立地与核小体DNA 结合(DNA 可以是核小体或核小体之间的),然后,这个转录因子再结

10、合1 个重塑因子,导致附近核小体结构发生稳定性的变化,又导致其他转录因子的结合,这是一个串联反应的过程;,2）重塑因子首先独立地与核小体结合,这些复合物都具有ATP酶活性，它们依靠水解ATP 所产生的能量来改变核小体的相对位置，但使其松动并发生滑动,将DNA 序列暴露出来，使转录因子能够与之结合。这是一个物理过程，染色质本身的结构并没有变化，只改变核小体的相对位置。,染色质重塑过程中,核小体滑动可能是一种重要机制,它不改变核小体结构,但改变核小体与DNA 的结合位置。,染色质结构重塑存在于基因启动子中,转录因子TF 以及染色质重塑因子与启动子上特定位点结合,引起特定核小体位置的改变(滑动),或

11、核小体三维结构的改变,或二者兼有,它们都能改变染色质对核酶的敏感性，指染色质特定区域对核酶稳定性的变化。基因组不同区域的染色质被不同浓度的酶水解的特性定义为基因组DNA对酶的敏感性。,用DNA酶I处理各种组织的染色质时，发现处于活跃状态的基因比非活跃状态的DNA更容易被DNA酶I所降解。原因：活跃表达的基因所在染色质上包含一个或数个DNase超敏感位点，常出现在转录基因的5端启动区，多在调控蛋白结合位点的附近，该处DNA裸露，易被核酸酶降解,鸡成熟红细胞（erythroblast）染色质中，-血红蛋白基因比卵清蛋白基因更容易被DNA酶I切割降解。鸡输卵管细胞的染色质中被DNA酶I优先降解的是卵

12、清蛋白基因，而不是-血红蛋白基因。,（2）组蛋白的修饰,组蛋白是染色质中核小体的主要结构元件。组蛋白的修饰（乙酰化、磷酸化和甲基化）所引起的结构变化能影响基因的开关，并且这种变化同样也调控着基因的转录，影响着基因的表达，是目前表观遗传学（Epigenetic)研究的重要部分。组蛋白的乙酰化过程由组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase,HAT)催化，目前已发现了4种组蛋白乙酰基转移酶和5种去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC),组蛋白的乙酰化-去乙酰化生物功能：,（1）乙酰化能促进基因转录的活性 在组蛋白特殊氨基酸残基上的乙酰化，可改变蛋白质

13、分子表面的电荷，影响核小体的结构，从而调节基因的活性；,乙酰化后组蛋白赖氨酸侧链不再带有正电荷，失去了与DNA的结合能力，也使相邻核小体的结合受阻，同时也促进泛素与组蛋白H2A的结合，导致组蛋白选择性降解。组蛋白H3和H4的Arg、Lys的-NH2是修饰的主要位点。,如：缺乏乙酰化能使雌性个体X染色体关闭转录，染色质凝聚程度增高。,（2）组蛋白乙酰化与转录起始复合物装配 组蛋白的乙酰化作用能导致组蛋白正电荷减少，削弱了它与DNA结合的能力，引起核小体解聚，从而使转录因子和RNA聚合酶顺利结合到基因DNA上。组蛋白乙酰化作用还能阻止核小体装配，使染色质处于比较松弛状态；组蛋白乙酰化作用还参与细胞

14、周期和细胞分裂的调控。,（3）组蛋白的去乙酰化与基因沉默 组蛋白低乙酰化或去乙酰化伴随着转录沉默或转录抑制。,如：失活的X染色体中H4组白完全没有乙酰化；H4的Lys16残基的去乙酰化作用对于维持基因沉默十分重要。,组蛋白乙酰化在转录调控中的作用示意图,3.非组蛋白对基因活性影响,真核生物的细胞核除了有构成染色质的组蛋白组分外，还有大量与染色质松散结合或在某些条件下才结合的非组蛋白（non-histone protein,NHP)组分。大部分是酸性蛋白，起蛋白质或酶的作用；具有种属和组织特异性；大多数是磷蛋白，以磷酸化/去磷酸化方式调节细胞的代谢、生长、增殖等。许多蛋白对染色质中基因的转录起始

15、非常重要。,高迁移率蛋白（high mobility group,HMG）：相对分子质量较小，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有很高的迁移率而得名.几乎所有的HMG都可以通过修饰、弯曲或改变染色质/DNA的结构,促进各种蛋白质因子形成大分子复合物来调节基因转录.根据其结构,HMG超家族可分为HMGA、HMGB、HMGN三类.,HMGA在早期的胚胎组织中含量很丰富，而在大部分的成体细胞中含量却相对的少。HMGA广泛参与细胞的各种生理活动，包括可诱导性基因转录的调控、将反转录病毒整和到染色体上、诱导转化及促进癌细胞研究等。HMGB发现最早，研究最多，在细胞中的含量也最丰富。不仅存在于细胞核内，还存在于胞浆内

16、或分泌到胞外，近几年还发现了膜相关的HMGB。最新一项研究表明（nature,2009)，染色体HMGB 蛋白HMGB1、HMGB2 和HMGB3是所有由核酸受体调控的先天免疫反应的激发所必不可少的，编码免疫球蛋白可变区的V、D、J基因片段重组、分化和发展等。,HMGN是一组与核小体结合的核蛋白，它们能够改变染色质的结构，增强染色质模板的转录和复制，HMGN家族包括HMGN1和HMGN2(原HMG-14和HMG-17)，它们在几乎所有哺乳动物和多数脊椎动物的细胞核中广泛存在。,4.核基质对基因活性的影响,在真核生物的细胞核内，存在一种主要由非组蛋白的纤维蛋白和大分子RNA组成的三维网架体系，这

17、就是核基质。真核基因组的DNA序列中，能特异性地与核基质紧密结合的区域即为核基质结合区(MAR)。它广泛存在于酵母到人类的所有真核生物基因组中。MAR位于DNA上各转录单位的交界处，是DNA在核基质或染色体支架上的附着点。这是通过一些特异的MAR结合蛋白与核基质结合，从而将染色质锚定在核基质上，以防其自由转动，并使DNA发生解链。同时还将DNA隔离成许多拓扑学限制性的功能区域，每个功能区域就形成一个拓扑学解旋的环，每个环就是一个转录单位。,核基质结合区约为200个富含AT的核苷酸区段，较为保守。通过氢键、疏水作用或共价键与核基质结合。,核基质蛋白包括：不溶性的纤维蛋白网状结构 核纤层核孔复合物

18、 核仁 非组蛋白,核基质的特点1限定DNA环状结构域的大小，使环状结构域成为相对独立的结构域与功能域，该功能域中包括一系列的转录单位及各种特异的顺式作用元件。如：限定子或绝缘子；绝缘子是一类新近发现的边界序列，它能阻止邻近调控元件对其所界定的基因启动子起增强和抑制作用。2.各种核基质蛋白之间相互作用，控制染色质组装的疏密程度，从而调节DNA的复制与转录；3.可能存在着基因的某种增强子元件；4.可能有DNA复制的起始位点识别元件,5.基因丢失,在细胞分化过程中，通过丢掉某些基因而去除其活性。例如某些原生动物，线虫、昆虫、甲壳类动物，体细胞常丢掉部分或整条染色体，只保留将来分化产生生殖细胞的那套染

19、色体。例如在蛔虫胚胎发育过程中，有27DNA丢失。在高等动植物中，尚未发现类似现象。还有许多生物各类不同的细胞或细胞核都具有全能性。,6.基因扩增,基因扩增(gene amplification):在没有发生细胞分裂，整条染色体几乎没有复制的情况下，细胞内某些特定基因的拷贝数专一性增加的现象。1)为满足正常的生长发育需要 如两栖类和昆虫卵母细胞rRNA基因的扩增:卵母细胞中的rDNA拷贝数比体细胞中增加了4000倍。在果蝇滤泡细胞中，编码卵壳蛋白的卵壳基因的扩增。2)外界环境因素引起基因扩增 基因扩增与肿瘤形成及细胞衰老有关。在原发性的视网膜细胞瘤中，含myc 原癌基因的DNA区段扩增10-2

20、00倍。许多致癌剂可诱导DNA扩增。,7.基因重排,将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。,通过基因重排调节基因活性的典型例子 免疫球蛋白结构基因（由B淋巴细胞合成的）酵母结合型转换,抗体分子IgG由4条（两对）多肽链组成，包括两条相同的轻链（L-chain）和两条相同的重链（H-chain）。轻链和重链在相对分子质量上有较大差别，前者约2.3x104，后者则介于5.3x104-7.0 x104之间。,免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白的肽链主要由可变区（V区）、恒定区（C区）以及两者之间的连接区（J区）组成,免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和

21、两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。,轻链的基因片段：,重链的基因片段：,所有Ig分子都含有两类轻链中的一类，即型或型。型和型轻链的恒定区和可变区的氨基酸序列是不同的。在小鼠中，95%的抗体轻链是型，而人类抗体轻链中，型和型各占50%左右。,H链和L链可能的组合数预计可达1011以上。小鼠每天生成的淋巴细胞为108个，可见动物一生中还不可能使全部可能产生的基因组合得到表达。,四.DNA水平上的调控,DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，而去甲基化则诱导了基因的重新活化与表达。DNA甲

22、基化会导致某些区域DNA构象变化，影响DNA的稳定性和蛋白质与DNA的相互作用，进而控制基因的表达。,1.DNA甲基化,如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常发育而死亡。CpG二核苷酸中C的甲基化导致了1/3以上由于碱基转换引起的遗传病。,DNA甲基化的主要形式 主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)，少量N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)和7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。在真核生物DNA中，胞嘧啶约有5%被甲基化，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG和CpXpG等序列中。,CpG二核苷酸序列通常成串出现并零散地分布于基因组中，此段序列被称为CpG岛。大约50%的CpG岛与看家基因有

23、关，另一半CpG岛存在于组织特异性调控基因的启动子中。,真核生物中的CpG岛与甲基化,如：哺乳类基因组中约存在4万个CpG 岛，它们大多位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点，其中有60%90%的CpG 被甲基化，CpG岛在基因表达调控中起重要作用。,不同结构基因上的CG岛,二氢叶酸还原酶,次黄嘌呤磷酸核糖转移酶,核糖体蛋白,DNA甲基化会导致某些区域DNA构象改变，包括甲基化后染色质对于核酸酶或限制性内切酶的敏感度下降，更容易与组蛋白H1相结合，DNase超敏感位点丢失，使染色质高度螺旋化,凝缩成团,直接影响了转录因子于启动区DNA的结合效率的结合活性，不能启始基因转录。DNA的甲基化不利

24、于模板与RNA聚合酶的结合，降低了转录活性。甲基化的CpG 可以与甲基化CpG结合蛋白因子MeCP1（methylCpG-binding protein1）的结合，间接影响转录因子与DNA的结合。,2.DNA甲基化对转录活性的影响,1）DNA甲基化可引起基因失活,甲基化对基因转录的影响,2）基因印记（遗传印记）,在生殖细胞形成早期，来自父方和母方的印记将全部被消除，父方等位基因在精母细胞形成精子时产生新的甲基化模式，但在受精时这种甲基化模式还将发生改变；因此在受精后来自父方和母方的等位基因具有不同的甲基化模式。,基因印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了修饰，使带有

25、亲代印记的等位基因表达不对称的现象。,印记基因的存在反映了性别的竞争，亲代通过印记基因来影响其下一代，使它们具有性别行为特异性以保证本方基因在遗传中的优势。印记基因的异常表达引发伴有复杂突变和表型缺陷的多种人类疾病。研究发现许多印记基因对胚胎和胎儿出生后的生长发育有重要的调节作用，对行为和大脑的功能也有很大的影响，印记基因的异常同样可诱发癌症。,基因印记常为DNA甲基化修饰，也包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。通常在启动子区等位基因有差异的甲基化修饰造成该基因表达量降低。,五 真核基因转录水平的调节控制,真核基因调控主要也是在转录水平上进行的，受大量特定的顺式作用元件（cis-acting el

26、ement）和反式作用因子（transacting factor）的相互作用来实现的。真核生物的转录调控是整个基因表达调控的关键点之一,1.真核与原核生物转录调控的区别,与原核生物比较的相同点 转录水平的调控+转录后调控，以转录水平的调控为重要 在真核生物结构基因的上游和下游（甚至内部）也存在着许多特异的调控成份。,与原核生物比较的不同点 1）原核生物的基因表达与调控是通过操纵子机制实现的。真核生物基因不组成操纵子，每个基因都有其自身的基本启动子和调节元件，单独进行转录，但在相关基因之间也存在着协同调节。,2）原核生物的调节元件种类较少，主要包括上游的启动区域调控元件和激活蛋白、阻遏蛋白的结合

27、位点；真核生物的调节元件种类很多，如：组成性元件、可诱导元件、应答元件、增强子和沉默子以及反式作用因子、阻遏因子等。,3）原核生物中有正调控（乳糖操纵子）和负调控。真核生物迄今已知的主要是正调控，而且一个真核基因通常都有多个调控序列，必须有多个激活物同时特异地结合才能启动基因的转录。4）原核染色体是裸露的DNA，染色质结构对基因的表达没有明显的调控。真核的染色质DNA与组蛋白紧密结合形成的核小体，染色质结构对基因的调控是明显的。,真核基因一般构造示意图,由若干可以区分的DNA序列组成，并与特定的功能基因相连，组成基因转录的调控区，通过与相应的反式作用因子结合，实现对基因转录的调控。,2 顺式作

28、用元件,一般情况下按功能分两类：核心启动子：保证转录起始所必需的、最少的DNA序列。核心元件包括上游2530bp处的TATA盒和转录起始位点附近的启始子（initiator，Inr），它能确定转录方向、起始位点并产生基础水平的转录。,1）启动子 概念：存在于结构基因上游，与基因转录启动有关的一段特殊的DNA序列。,TATA框又称Hogness框，Goldberg-Hogness框，俚语称为金砖（Goldbrick），其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50，常在起始位点的上游-25左右，相当于原核的-10序列。（但原核生物-10序列不可缺少的，而真核启动中有的可缺乏TATA框。

29、）TATA框作用：(1)选择正确的转录起始位点，保证精确起始，故也称为选择子（selector），当有的基因缺少TATA框时，可能由Inr（initiator）来替代它的这一作用，如鼠的脱氨核苷转移酶（Tdt）基因就没有TATA框，但有17bp的Inr；(2)影响转录的速率。TATA框的8bp的保守序列一般都是由A，T对组成，较容易打开。当它的序列因发生突变和缺失而改变时就会影响它和酶的结合能力，从而影响转录的能力。,sextama box,上游启动子元件：在转录起始点上游存在CAAT盒和GC盒，它们基本不参与起始位点的确定，起调节起始的频率，提高转录效率的作用。CAAT box的保守序列是G

30、GCTCAATCT，一般位于上游-75bp左右紧靠-80，其功能是控制转录效率。能和CTF（识别CATT的转录因子）相结合。GC box的保守序列是GTGGGCGGGGCAAT，常以多拷贝形式存在-90处。在真生物和病毒的一些启动子中常存在GC框，可被转录因子SP1所识别。它的作用也是控制转录起始频率。如鼠二氢酸叶酸还原酶启动子，猴基因组中的双向启动子，SV40，疱疹病毒等基因的启动子中。还有其它的一些UPE，如八聚体（Octamer），KB，ATF等。有些缺失TATA的基因不含UPE，但常有下游启动子元件。,不同基因转录的启动子区结构图,胸腺嘧啶激酶,-珠蛋白,SV40早期基因,组蛋白H2B

31、,2）增强子,Enhancer,Gene,5,3,direction of transcription,Enhancer,Enhancer,增强子（Enhance)是指能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。作为基因表达的重要调节元件，增强子通常具有下列性质：1、具有远距离效应。增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍。2、增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（53或35），甚至和基因相距30kb，或在基因下游，均表现出增强效应；,3、大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。4、其内部常含有一个核心序列，是产生增强效应时所必需的；5、增

32、强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；6、没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；7、许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。,增强子可能有如下3种作用机制影响模板附近的DNA双螺旋结构，导致DNA双螺旋弯折或在反式因子的参与下，以蛋白质之间的相互作用为媒介形成增强子与启动子之间“成环”连接，活化基因转录；将模板固定在细胞核内特定位置，如连接在核基质上，有利于DNA拓扑异构酶改变DNA双螺旋结构的张力，促进RNA聚合酶II在DNA链上的结合和滑动；增强子区可以作为反式作

33、用因子或RNA聚合酶II进入染色质结构的“入口”。,增强子的作用机制,为真核生物中负调控元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。最早在酵母中发现，可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用。,3）沉默子,沉默子的作用特点：不受序列方向的影响，能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。,4）基因座控制区,基因座控制区(locus control region,LCR)是染色体DNA上一种顺式作用元件，结构域中含有多种反式作用因子的结合序列，可能参与蛋白质因子的协同作用，使启动子处于无组蛋白状态。,绝缘子(insulator)长约几百个核苷酸对，是通常位于启动子同正调控元件(增强子)

34、或负调控因子之间的一种调控序列。绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用能阻止正调控或者负调控信号在染色体上的传递，阻断包括增强子、沉默子和LCR的作用，使染色体活性限制在一定结构域内，即：不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。,5）绝缘子,3.反式作用因子,反式作用因子是参与转录调控的蛋白因子，能直接地或间接地识别或结合在各类顺式作用元件上，与顺式作用元件一起对转录起调控作用。通过蛋白质-DNA，蛋白质-蛋白质相互作用是其发挥功能的基础。以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子（transcription factors，TF）。,（1）反式作用因子的类型,a.

35、通用反式作用因子 和RNA聚合酶一起结合于转录起始点和TATA盒；b.上游激活元件 特异性识别短共有序列元件的转录因子。结合于启动子或增强子位点上。通过增加基本转录复合体(basal apparatus)结合于启动子的效率而起作用；c.辅助激活因子 连接激活因子和基本转录复合体；d.与应答元件相结合的反式作用因子/一些调节因子(Some regulators)可使染色质结构改变。,1）反式作用因子概述,（2）反式作用因子中的结构域 a.DNA识别结合域(DNA-binding domain)反式作用因子结构中用来同顺式作用元件结合的结构区域，主要起结合DNA作用。b.转录活化结构域(trans

36、criptional activation domain）反式作用因子结构中用来同其他蛋白因子结合，参与募集启动子结合蛋白形成转录起始复合体，控制基因转录活化的结构区域。c.二聚化结构域（dimerization domain)反式作用因子含有介导蛋白质二聚化的位点，二聚体的形成对它们行使功能具有重要作用。,转录因子的DNA结合域和活化结构域是独立发挥作用的，DNA结合域的功能只是把活化结构域“拴在”起始复合体附近，使之能够发挥活化转录的作用。DNA结合域把活化结构域带到转录起点的附近，而DNA结合域和活化结构域之间的联结区域(connector)是具有足够柔性的，这样，不论DNA结合域所结合

37、的具体位点在哪里，都能使活化结构域找到其靶蛋白（转录因子）。,转录因子对特定DNA序列的识别和结合，很多情况下都是转录因子的某些氨基酸残基形成的-螺旋结构侵入到双链DNA的大沟中，通过氢键、静电荷作用等方式形成较稳定的结合方式。,2）反式作用因子中的DNA结合结构域(DNA binding domain,DB),每一个DNA结合结构域有一个与DNA序列相互作用的基序（motif),多数基序含有一个插入DNA大沟的片段，能识别大沟的碱基序列。常见有：螺旋-转角-螺旋（Helix-turn-helix，H-T-H）锌指结构（Zinc finger）亮氨酸拉链（Leucine zippers）螺旋-

38、环-螺旋（helix-loop-helix）同源异形结构域（homeodomain,HD),（1）螺旋-转角-螺旋(H-T-H)结构,该结构域长约20个氨基酸，包含两个-螺旋区和螺旋区中间的转折区，主要通过一个靠C端的-螺旋与DNA双螺旋大沟结合。,（2）锌指（Zinc finger）结构,A.锌指蛋白（经典的锌指结构）：包括二个半胱氨酸(Cys)及二个组氨酸(His)族，其保守重复序列为Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His。其中的Cys和His残基与锌离子(Zn+)形成的配位键，使氨基酸折叠成环，形成类似手指的构型。此结构被称为Cys2/His2锌

39、指。,该名称来源于它的结构，它由一小组保守的氨基酸和锌离子结合，在蛋白质中形成了相对独立的功能域，像一根根手指伸向DNA的大沟。常见两种类型，一类是锌指蛋白，另一类是固醇类受体。,经典锌指结构示意图,经典锌指结构示意图,具有Cys2/His2锌指结构域的一些转录因子,344aa，N端与DNA结合,有9个锌指，共结合45个碱基,与5s rRNA基因启动子区C框结合。,TFA结构域示意图,B.固醇类受体:具有Cys-X2-Cys-X13Cys-X2-Cys样的保守序列，Zn+与4个Cys结合称为Cys2/Cys2锌指，这些蛋白一般无大量重复性锌指，其DNA结合序列较短且对称。这种结构域常出现在类固

40、醇激素受体蛋白，酵母的GAL4转录因子也具有一个这样的锌指结构。Cys2/Cys2锌指与Cys2/His2锌指结构不同，Cys与His是不能互换的。,类固醇激素受体是以二聚体形式发挥其促进转录作用的。它们的两个锌指的功能不同。第1个锌指的右侧控制与DNA结合，第2个锌指的左侧则是控制形成二聚体的能力的。,糖皮质激素特异性,雌激素特异性,（3）亮氨酸拉链（Leucine zippers）,结构特点为蛋白形成的-螺旋结构上每隔7个氨基酸就有一个亮氨酸残基，这些亮氨酸出现在-螺旋的一个方向，每两个蛋白组成一个二聚体，使亮氨酸相对排列，形成拉链样结构，在拉链区的氨基端有个约30个残基的碱性区(富含赖氨

41、酸和精氨酸)。此区的作用是与DNA结合，它也形成-螺旋。,亮氨酸拉链是一种富含亮氨酸的蛋白链形成的二聚体模体。它本身形成二聚体同时还可以识到特殊的DNA序列。,亮氨酸拉链结构示意图,肝脏、小肠上皮、脂肪以及某些脑细胞中存在一类C/EBP家族蛋白，GCN4酵母激活因子、CREB（cAMP应答元件结合蛋白）、热休克蛋白原癌基因jun,fos编码产物，它们都具有典型的亮氨酸拉链结构。,（4）螺旋-环-螺旋（basic-helix-loop-helix）,蛋白质的C端的氨基酸残基形成两个-螺旋，中间被非螺旋的环状结构隔开，蛋白质的N端是碱性区，为DNA结合区。碱性-螺旋-环-螺旋类蛋白通常组成二聚体的

42、形式，才具有结合DNA的能力。肌细胞定向分化调控因子MyoD-1、原癌基因产物Myc及免疫球蛋白链基因增强子蛋白E12都具有这种bHLH结构，而还有一些蛋白因子（如ID等）具有HLH样结构，无碱性区，就不能结合DNA。,二聚体bHLH蛋白与DNA结合模式图,（5）同源异形结构域（homeodomain,HD),许多反式作用因子结合DNA的结构域中具有一段相同的保守序列，是60个左右氨基酸组成的螺旋-转角-螺旋结构的区域，称为同源异形结构域，简称同源域。含3个螺旋。,同源域蛋白结合DNA示意图,靠C端的螺旋3结合在DNA的大沟中，它是蛋白质和DNA的主要接触部位。螺旋1和螺旋2为反平行样式，它们

43、与螺旋3近于垂直，在结构域N端有个伸展的臂与DNA小沟结合，提高结合的稳定性。,3）转录因子的激活结构域（active domain,AD),一般是DNA结合结构域以外的20-100氨基酸残基组成，它们与DNA结合结构域在空间和功能上是分开的，主要包括以下几种特征性结构酸性-螺旋结构域(acidic helix domain)富含谷氨酰胺结构域(glutamine-rich domain)富含脯氨酸结构域(proline-rich domain),a.酸性-螺旋(acidic-helix)该结构域含有由酸性氨基酸残基一侧组成的保守序列，多呈双亲性的-螺旋结构，富含酸性氨基酸，为亲水性，另一侧含

44、疏水性氨基酸。包含这种结构域的转录因子有GAL4、GCN4、糖皮质激素受体和AP-1/Jun等。,增加激活区的负电荷数能提高激活转录的水平。可能是通过非特异性的相互作用与转录起始复合物上的TFIID等因子结合生成稳定的转录复合物而促进转录。,b.谷氨酰胺丰富区(glutamine-rich domain)氨基酸组成中有25%的谷氨酰胺，很少有带电荷的氨基酸残基。如：SP1含有2个主要的转录激活区，酵母的HAP1、HAP2和GAL2及哺乳动物的OCT-1、OCT-2、Jun、AP2和SRF也含有这种结构域。,c.脯氨酸丰富区(proline-rich domain)CTF家族（包括CTF-1、C

45、TF-2、CTF-3）的C末端与其转录激活功能有关，含有20%-30%的脯氨酸残基，其它如Oct2、Jun哺乳动物转录因子中也富含这种结构。,4)转录调控的作用机制,真核细胞细胞核中共有3类RNA聚合酶,RNA聚合酶的启动子结构复杂，且序列变化很大，与转录启动有关的位点包括4个部位：帽子位点（转录起始点），其碱基大多为A；-25附近的TATA框；-75附近的CAAT框；-100以上的远上游序列，即增强子。转录要起始，需很多的转录因子参与，如：通用转录因子、DNA结合的转录因子和辅助转录因子。,（1）转录因子之间的相互作用,酵母菌半乳糖代谢的正调控系统早在1900年就被发现,是真核生物中最早作为

46、基因调控研究的系统之一。半乳糖的存在与否决定半乳糖代谢基因是否表达：在没有半乳糖时，基因不表达；加入半乳糖后，mRNA浓度可迅速增加1000倍。半乳糖基因是受GAL4调控蛋白调控，GAL4和调节基因上游元件UAS结合，促进转录。,UAS序列具有4个GAL4蛋白质(Gal4p)结合位点，无论基因是否转录，这四个位点总是与Gal4p结合GAL80P总是与GAL4P结合，覆盖了GAL4P的活性中心，当磷酸化的半乳糖与GAL80P/GAL4P复合体结合时，改变他们的构型，使GAL4P的活性中心外露，集中其他转录因子，使GAL基因表达。,基因转录的起始除了需要通用转录因子和结合DNA的转录因子外，有的基

47、因转录过程还依赖于增强子、介导因子或辅助激活因子的共同作用。,（2）介导因子,介导因子可与RNA聚合酶II互作来增强转录；介导因子不能直接结合DNA，但与RNA聚合酶II未磷酸化的CTD结合，形成完整RNA聚合酶II复合物，一旦转录开始，CTD磷酸化使得介导因子与RNA聚合酶II解离，RNA聚合酶II沿DNA延伸，而介导因子则参与新一轮的转录重复起始。,转录调节中的激活与抑制是相辅相成的两个方面，某个特定基因的转录方式取决于正负调控因子之间的平衡。真核细胞主要通过控制染色质的结构，从整体上对转录因子加以控制，而较少采取类似于原核阻遏物那样的机制；在真核生物中，并非所有的调节蛋白都是激活蛋白，也

48、有一些是阻遏蛋白，它们可以通过不同的方式发挥作用。,（3）真核生物转录调控的阻遏作用,5）固醇类激素对基因转录的调控,固醇类激素是疏水性很强的化合物，可经扩散通过质膜进入细胞。在细胞中，固醇类激素与其受体结合形成二聚体。而固醇类受体本身是一组转录因子，具有与DNA结合的保守序列。这种二聚体一旦与目的基因启动子结合，即可直接启动目的基因转录。而且，固醇类受体必须在固醇类存在时，才能与DNA结合，起始基因转录。固醇类激素受体属于核受体。,（1）受体的类型,根据在细胞内分布的不同,膜受体胞内受体,胞内受体/核受体：主要于细胞核内，或在胞浆中结合配体后也转入核内，调节基因表达。作用：调节基因的转录 如

49、：类固醇激素受体、甲状腺素受体,(2)4种途径,1、通过cAMP途径2、钙及肌醇三磷酸作用途径3、受体的酪氨酸激酶途径4、固醇类激素受体调节基因转录速度,典型的核受体由A/B、C、D、E和F（从N末端到C末端）等5个区域组成：N末端结构域（A/B结构域）为转录激活域，是整个蛋白可变性最高的部分，其长度从50个到500个氨基酸不等；C结构域为DNA结合域，是最保守的区域；D结构域是铰链区，起连接DBD和LBD两个结构域的作用；核定位信号NLS位于C和D之间；E结构域，即配体结合域，是最大的结构域，其保守性仅次于DBD。在A/B和E结构域分别存在着不依赖于配体的转录激活域AF-1、配体依赖型的转录

50、激活域AF-2。,（3）核受体（nuclear receptor)的结构,激素受体元件HRE,（4）固醇类激素受体对基因转录的调控,六.转录后水平的调控,1.可变剪接/选择性剪接（alternative splicing),在高等真核生物个体发育或细胞分化过程中可以有选择性地越过某些外显子或某个剪接点进行变位剪接，产生出组织或发育阶段特异性mRNA，称为内含子的可变剪接。脊椎动物中许多基因能以这种方式进行剪接，保证各同源蛋白质之间既具有大致相同的结构或功能域，又具有特定的性质差异，进而拓展了基因所携带的遗传信息。,（）外显子跨越或外显子缺失；（）外显子延长；（）内含子保留；（）外显子交替。在人