《病毒载体》PPT课件.ppt

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1、1,病毒载体,万海英,2,复杂的遗传背景、环境因素和社会因素使得人类遗传性疾病、恶性肿瘤、心脑血管性疾病、糖尿病等疾病的发病率和死亡率日益上升，治疗这类疾病对于医学界是巨大的挑战。基因结构及基因表达调控异常是上述疾病发生发展的重要原因，通过DNA重组技术纠正这些异常无疑将为这些疾病的治疗策略带来革命性的变化。基因治疗是这些策略中最直接、最富于挑战性，也可能是最有前景的尝试。,3,基因治疗（gene therapy）是指改变人遗传物质为基础的生物医学治疗，即通过一定方式将人正常的或野生型的基因或有治疗作用的核酸片段导入人体靶细胞以矫正或置换疾病基因的治疗方法。,4,将治疗性基因转入真核细胞内是基

2、因治疗的前提。由于DNA是超螺旋或开环结构，空间结构太大而不能主动进入细胞，因此必须借助一定的方法将其导入细胞中。通常把基因治疗中将基因导入细胞内的运载工具称作基因转移系统或“载体”（vector），目前所用的基因转移方法可分为非病毒方法和病毒方法两大类，各有优缺点，关键问题是提高转移效率。,5,非病毒方法包括脂质体法、磷酸钙法、电穿孔法、微离子轰击法、直接注射法等物理化学方法。但非病毒基因转移方法的效率较低，在很多情况下不能满足治疗需要。因此，科学家希望找一种合适的载体。,6,理想的基因治疗的载体具有的特点：可以有效的进入靶细胞具有可插入治疗基因的较大空间和筛选标志具有控制治疗基因表达的顺式

3、作用元件。由于病毒具有靶细胞定向感染和宿主细胞寄生性两大特征，很适宜于改造成基因转移的载体，因此病毒载体得到广泛使用。据统计基因治疗临床试验中70%采用了病毒作为基因转移的载体。,7,病毒载体,病毒载体发展简史病毒载体的基本特征病毒载体,8,病毒载体发展简史,1968年 Rogers和Pfunderer在研究烟草花叶病毒时，将一段poly(A)n序列加到了烟草花叶病毒基因组 RNA的尾端，然后将病毒注射到植物叶片中，结果在分析该植物的成分时发现多聚赖氨酸的表达水平明显增高了。生化中学习过核苷酸密码子，AAA编码赖氨酸 AAA lysine,9,1972年Berg等在一系列的研究中发展了第一种建

4、立在SV40基础上的重组病毒载体，并将噬菌体部分DNA片段和大肠杆菌半乳糖操纵子连接到 SV40 DNA中。1976年，带有噬菌体DNA的重组SV40载体在猴肾细胞中得到繁殖。,10,1976年Hamer等人组建了类似的携带大肠杆菌抑制基因的 SV40病毒。后来，研究者用反转录酶和DNA聚合酶在体内合成了兔珠蛋白全长cDNA，用它取代SV40病毒的主要外壳蛋白VP1的基因位置，形成的重组质粒在被注射的细胞中表达了兔-珠蛋白。,11,DNA病毒和RNA病毒都可以作为基因治疗的载体。病毒基因组的编码区基因主要为其衣壳蛋白、酶和调控蛋白编码基因，而非编码区中则含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式

5、作用元件。病毒基因组必须经过切除改造，无致病作用后才可作为基因治疗载体使用。改造的方法是切除病毒复制必须的基因和致癌基因，或将其复制必须的基因置于特异调控序列的操纵之下。,12,在病毒生产时，原有必需基因的功能改由辅助病毒或包装细胞提供。由于野生型病毒插入外源基因的大小不能超过自身基因组大小的105-110%，因此切除改造的目的除确保病毒载体的安全性外，同时也获得了插入外源基因的空间。经过改造的病毒，保留了感染性，去除了致病性，成为介导治疗性基因进入细胞的良好载体。,13,目前用做基因转移载体的RNA病毒均属于逆转录病毒科，包括反转录病毒、慢病毒和泡沫病毒。用做基因转移载体的DNA病毒则包括腺

6、病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒，以及痘苗病毒、禽痘病毒、埃巴病毒等。,14,病毒载体的基本特征,病毒载体用于基因治疗有以下优点：转移效率较高在转化的细胞中将外源基因整合到染色体上或作为染色体外的遗传物质进行表达，两种途径可供选择有可能将外源治疗基因置于病毒调节信号的控制下进行表达能够将外源基因作为病毒微染色体的一部分，并能进行分离,15,病毒载体作为基因治疗的工具存在的问题：尽管病毒载体介导的基因转移在临床上已经取得了一定得疗效，但是它还存在着一些亟待克服的缺陷。宿主谱窄基因导入效率低外源基因表达不够长期稳定表达缺乏有效调控感染的靶向问题以及对机体的毒性问题等等。,16,如何解决上述问题呢？在

7、充分认识病毒生物学特性、基因组结构及其基因表达调控规律的基础上，对现有病毒载体进行重组改造，以提高基因转移、表达的效率和靶向性，已成为基因治疗研究能否获得突破性进展的关键。,17,病毒载体,DNA病毒载体 腺病毒载体 腺相关病毒载体 单纯疱疹病毒载体RNA病毒载体 逆转录病毒载体 慢病毒载体,18,腺病毒最早发现于1953年，是一种无包膜的DNA病毒，可引起上呼吸道和眼部上皮细胞的感染。人的腺病毒共包含50多个血清型，并根据其凝血特性分为A-F五个亚类。C亚类的2型和5型人腺病毒在人体内基本不致病，因此适合作为基因治疗的载体。,腺病毒载体,19,腺病毒的生物学特点,可以引起人类呼吸道、眼睑的急

8、性感染。可以引起人类扁桃体、腺样体和其他淋巴组织的潜伏感染。可以引起小鼠非允许细胞的转化，某些亚型可以导致新生地鼠的致癌作用。易于培养和纯化；它的基因表达和控制系统与宿主细胞的基因表达和控制系统相似；因此可以作为真核基因表达控制系统研究的模型。,20,人腺病毒基因组为长约36kb的双链线状DNA分子，两端各有一个100-160bp的反向末端重复序列（inverted terminal repeats，ITR），ITR的内侧为包装信号，是病毒包装所需要的顺式作用元件。基因组包含早期表达的与腺病毒复制相关的E1-E4基因和晚期表达的与腺病毒颗粒组装相关的L1-L5基因。,21,编码基因区域：E1:

9、E1A、E1B 早期蛋白 E2:E2A、E2B E3:E4:晚期蛋白 L1、L2、L3、L4、L5 非编码基因区域：反向末端重复序列（ITR，100-160bp）包装信号(5末端194-385bp)病毒基本结构（最小病毒载体基本结构）,22,基因组中，E1、E2、E4编码病毒DNA复制所必需的调节蛋白。E1区基因表达产物可以进一步分为E1A和E1B。E1A是腺病毒感染细胞后表达的第一个基因，主要功能是调节细胞代谢，使细胞对病毒复制更易感；E1B19Kd与细胞Bcl-2基因的表达产物同源，可以通过灭活和清除Bax家族成员来防止细胞发生凋亡或坏死，营造有利于腺病毒复制的细胞内环境。E1基因可以激活

10、E2基因，使其表达。,23,E2区基因表达产物可分为E2A和E2B。其中，E2A即DNA结合蛋白（DBP，DNA Binding Protein）；E2B主要产物有两种，分别是末端蛋白前体（pTP）和病毒DNA聚合酶（pol）。三种蛋白与至少三种细胞内的因子相互作用，启动腺病毒DNA复制以及病毒晚期基因的转录和翻译过程。,24,E3区基因表达产物主要功能是破坏宿主的免疫防御机制，而与病毒基因组的复制无关。E3基因的产物之一11.6Kd蛋白，由于可以在病毒感染的晚期裂解细胞并释放病毒颗粒而被称为腺病毒死亡蛋白（ADP，adenovirus death protein）。gp 19Kd蛋白可以在内

11、质网上与MHC I类分子的重链结合阻止其转运到细胞表面，并且可以延缓MHC I的表达。14.7Kd蛋白可以抑制由TNF诱发的细胞凋亡，促进Fas降解，下调TNF受体水平。,25,E4区基因表达产物通常被称为orf 16/7，主要与病毒信使RNA的代谢有关。还有促进病毒DNA复制以及关闭宿主蛋白合成的功能。研究发现，一些E4产物可以与DNA激活的蛋白激酶结合，防止病毒DNA发生串联。由于该激酶可以激活p53基因，因此可以认为一些E4区基因产物可以抑制细胞凋亡。许多E1B和E4基因产物都与拮抗E1A蛋白功能有关。比如，E4 orf4抑制E1A对E2F启动子的激活；E4 orf3VA RNA是一些由

12、腺病毒转录的非翻译RNA，与腺病毒抵抗宿主细胞免疫有关。,26,腺病毒载体的构建和改造主要围绕E1-E4基因展开的，突变或缺失其中的一个、几个或全部，或对其调控序列进行特异替换。,27,第一代重组腺病毒载体,在第一代重组腺病毒载体中，E1和/或E3 基因盒子被去除，可以容许导入6.5 kb 的外源基因DNA，并且由异源性的启动子控制其表达。在 E1盒子缺失的情况下，要特别仔细防止ITR和包装信号序列被去除。其缺失的功能由包装细胞来完成。腺病毒的包装细胞包括 293，911，N52.E6 and PER.C6 等。,28,第一代腺病毒载体感染宿主细胞的过程,29,第一代腺病毒载体的优点,1.基因

13、转移效率高，广泛的宿主范围，既可以是分裂期细胞，也可以感染非分裂期细胞 2.产生很高的病毒滴度，1011-1012pfu/ml，并易于制备和操作。（PFU:plaque forming unit，空斑形成单位。感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。）3.可以携带的外源基因的容量是：6.5kb 4.外源基因独立于染色体之外表达，不发生整合，因此不会发生插入突变。,30,存在的问题,腺病毒的免疫原性较强，体内应用容易引起炎症反应和系统毒性。2.腺病毒载体携带的外源基因只能在靶细胞中瞬时表达，不能作为治疗剂长期发挥作用3.缺失E1B 基因产物导致有效地抗凋亡机制的丧失。在E3产物缺失时产生与E1B

14、 基因产物类似的效果。,31,4.可以产生有复制能力的腺病毒(replication-competent adenovirus，RCA)一个原因是细胞中存在E1样蛋白，可以模拟E1蛋白的部分功能，激活E2基因的转录，导致有复制能力的腺病毒产生。另一个原因是在很高的病毒滴度时，E2基因转录对E1基因的依赖性被削弱，导致E2基因的转录，有复制能力的腺病毒产生。,32,第二代腺病毒载体,为了克服第一代载体的缺点，对腺病毒进行进一步的改造。将E2基因和/或E4基因的部分或者全部去除，因此，病毒DNA复制的能力消失，有复制能力的病毒产生机率降低。有复制能力的病毒的产生也可以通过构建不含腺病毒载体重叠序列

15、的细胞系做为病毒复制的辅助细胞的方式阻止其产生。,33,优点与存在的问题,外源基因的容量增加了：14kb外源基因的表达时间比第一代病毒载体有所延长，但仍然不能长期持续表达。宿主的免疫反应仍然是影响外源基因持久表达的主要障碍，特别是在发生重复感染的时候这种作用尤其明显。,34,第三代重组腺病毒载体,第三代腺病毒载体的构建是将病毒的其他基因全部或接近全部删除。这就是所谓的“空肠病毒”载体，它仅保留了ITR和包装信号序列，因此需要辅助病毒和适当的包装细胞用于病毒的繁殖，病毒的获得需要仔细的纯化。,35,而且，这些新技术也带来新的问题，主要是由辅助病毒污染及载体的不稳定性所引起。构建载体的一个因素是需

16、要维持载体的正常大小才能完成有效地DNA的包装。这个问题可以通过“填充”DNA来完成，尽管这些填充DNA片段的性能可以影响转基因的表达。已经明确E4基因的部分保留有利于宿主细胞战胜T细胞免疫反应从而有利于病毒生存，因此改造载体时可以保留部分E4基因。,36,为了解决辅助病毒造成的污染问题，最近的改造载体系统引入了Cre-loxP 辅助依赖系统，该系统可以在特定时段将辅助病毒基因去除，从而避免包装时产生辅助病毒的基因污染问题。辅助病毒污染问题解决了，但是也存在着一定的细胞毒性问题。,37,为了解决病毒载体的细胞毒性问题引入了腺病毒载体的ITR区与其他病毒相杂交的策略，从而有利于转基因的表达。使用

17、相似的策略，将鼠白血病病毒的长末端重复序列与腺病毒载体杂交，这一系统改造使得腺病毒载体能够在体内外持久的表达转基因。这就形成了一套新的载体系统，嵌合载体。来自其他种属的腺病毒（禽类，羊，牛，犬类等）用于构建基因治疗的病毒载体，这些病毒通常不会引起局部体液免疫反应。,38,靶向性腺病毒载体,野生型的腺病毒(Ad-wt)具有完整的E1基因，可以启动早期蛋白的表达和腺病毒的复制。非复制性腺病毒(Ad)将E1A基因完全删除，这样病毒不能传代，除非在包括表达E1A基因的包装细胞的辅助下才能完成。载体中插入肿瘤特异性启动子后，该启动子使肿瘤细胞获得转录互补功能，而在非肿瘤细胞中不存在此功能。,39,肿瘤靶

18、向性腺病毒载体,40,41,确保载体有效表达的策略,将免疫反应和凋亡反应最小化。保留E3基因盒子 或者给与抗CD4试剂治疗，能够降低T辅助细胞免疫反应。删除E4基因盒子 可以降低Th2和B 细胞活性CD8融合于TNFa受体的胞外区 能够降低体液免疫反应。TNF诱导的凋亡反应可以被E3基因产物阻断。,42,影响转基因传递的因素。细胞受体 CD3,成纤维母细胞生长因子,肝素或者胃泌素等使用来自流感病毒的血凝素多肽,43,确保转基因表达。启动子和增强子元件。,44,腺病毒载体的临床应用,1.用于肿瘤的基因治疗：由于腺病毒载体可以实现治疗基因的短暂高表达，因此在肿瘤基因治疗中具有无可比拟的优势。HSV

19、-tk自杀基因腺病毒载体用于头颈部癌症、非小细胞肺癌、前列腺癌等的治疗研究 用于转移IL-2、GM-CSF等细胞因子和p53等抑癌基因，治疗神经胶质瘤、头颈部肿瘤等研究。2.用于遗传性疾病的基因治疗：如用于纠正囊性纤维化中囊性纤维化跨膜通道调节因子（CFTR）基因缺陷,45,3.作为辅助性治疗手段：如腺病毒载体将鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）基因转移入高血氨症患者的肝细胞，可以部分恢复该基因的功能，血中鸟氨酸转氨甲酰酶的浓度接近正常水平，使血氨水平降低。4.其他应用：心血管疾病的基因治疗，用于转移血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等。,46,47,48,49,腺相关病毒载体,腺相关病毒（aden

20、o-associated virus，AAV）属于人类细小病毒属，基因组为单链DNA，复制缺陷型病毒，无致病原性。,.,50,AAV复制周期由两个明显的阶段构成：潜伏期和增殖期。在辅助病毒诸如腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒或者在基因毒存在的条件下,AAV能复制产生子代病毒颗粒。在缺少辅助病毒的情况下，腺相关病毒整合其基因组到19号染色体的一个特别位点并保持整合状态直到随后的辅助病毒将其从潜伏状态下拯救出来。AAV的位点特异性的整合能力、其复制的自然缺陷以及其无致病原性使其成为基因治疗载体成为可能。,51,腺相关病毒基因组,4679bp,非结构蛋白：Rep(Rep68,Rep78,Rep40 和 R

21、ep52)结构蛋白：Cap(VP-1,VP-2,和 VP-3.)启动子：p5,p19,和 p40 ITR:(-145 bases),52,AAV基因组是一个线性、单链(ssDNA)分子，4679个核苷酸，在每个末端含有一个145个碱基末端重复序列 ITR 反向末端重复序列是AAV复苏、复制、包装和整合所需要的唯一元件。,53,Rep:Rep68 和 Rep78已知在AAV基因组的复制、调节AAV启动子的转录、指导AAV基因组位点特异性定向整合到宿主细胞19号染色体等过程中发挥着重要的作用。Rep52 和Rep40对单链载体基因组的产生有非常重要的作用。,54,Cap病毒壳粒完整组装仅需要VP2

22、和VP3蛋白，其中VP-3蛋白占主要部分大约占二十面体结构的90%。突变VP-1蛋白NH2-末端的局部区域所产生的载体DNA病毒颗粒其传染性明显降低。,55,AAV载体基因组结构,56,AAV载体介导的转导,57,生产rAAV的策略,58,腺相关病毒载体的特点,整合于宿主细胞染色体，长期稳定表达 具有广泛的宿主范围，既可以感染分裂期细胞，也可以感染非分裂期细胞对宿主细胞很低的毒性和免疫原性，致病性弱,59,存在的问题,1.由于需要辅助病毒协助才能产生成熟的病毒颗粒，产生的病毒滴度低2.外源基因的容量仅为3.失去了特异的定向整合作用（chr19，q13.3和qter之间）,60,腺相关病毒载体的

23、应用,单基因遗传病的基因治疗 地中海贫血：携带正常的珠蛋白基因，纠正红细胞的缺陷 囊性纤维化病：表达正常的囊性纤维化跨膜通道调节因子,61,单纯疱疹病毒载体,单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）是有包膜的双链DNA病毒，属于疱疹病毒科。,62,单纯疱疹病毒在病毒学上的特点,具有广泛的宿主细胞范围，包括非分裂期细胞和分裂期细胞。复制周期短。致细胞病变作用和抗原性强大。在感染过程中存在杀细胞效应和潜伏型感染。在细胞培养中很容易扩散。在神经节常出现潜伏感染。,63,HSV-1 genome organization,64,HSV有包膜的双链DNA病毒，其基因组长度约为15

24、2kb，包含70-80个基因。HSV基因组有2部分：长片段(L)和短片段(S)，中间为L-S接点区由共价键连接。HSV-1的复制和细胞毒效应主要由病毒的ICP4、ICP22、和ICP27等蛋白介导，用目的基因取代这些蛋白的基因，可以构建治疗用的HSV载体。,65,HSV Vector,66,单纯疱疹病毒载体的特点,具有广泛的宿主范围，包括非分裂期细胞和分裂期细胞。病毒颗粒相对稳定。产生的病毒滴度在104 和 108之间。可插入基因的容量巨大：30kb-50kb，能够将整个基因和调控序列全部插入到载体中。感染恶性肿瘤细胞可以诱导细胞坏死的发生。HSV载体能够在神经细胞中发生潜伏感染，使外源基因表

25、达的时间持续很长的时期。,67,存在的问题,不整合于染色体，只能进行瞬时表达。许多基因产物都对宿主细胞有毒性，因此引起宿主细胞的强的免疫反应、炎症和系统毒性。基因组结构复杂，基因表达的控制性低。,68,单纯疱疹病毒载体的应用,1.由于病毒本身的向神经性，对神经系统疾病具有特殊的效果。恶性胶质细胞瘤 2.对肿瘤的基因治疗 感染并杀死肿瘤血管内皮细胞，在体内外发生抗血管效应。,69,逆转录病毒载体,逆转录病毒是有包膜的、具有2条相同的线性单链RNA病毒。,70,人类免疫缺陷病毒,猴类免疫缺陷病毒,猫类免疫缺陷病毒,马传染性贫血病毒,人类T细胞性白血病病毒,小鼠乳房肿瘤病毒,禽类白细胞增生病毒,小鼠

26、白血病病毒,牛粪病毒,人泡沫病毒,人内源性逆转录病毒,牛败血病病毒,逆转录病毒属,慢病毒属,泡沫病毒属,逆转录病毒家族,71,逆转录病毒基因组,（致癌性）逆转录病毒属Retrovirus慢病毒属Lentivirus泡沫病毒属Spumavirus,72,基因组大小在10kb左右。基因组两端是序列相同而又不转录的长末端重复序列（Long terminal repeat，LTR）。从5端LTR 之后依次是gag、pol、env三个结构基因。,73,前病毒基因组转录出一条前体mRNA。gag 基因编码病毒核心蛋白。pol 基因编码病毒复制酶。蛋白酶：将病毒前体蛋白裂解为成熟的形式。逆转录酶：病毒转录所

27、必需 整合酶：将病毒基因组整合于宿主细胞染色体DNAenv 基因编码病毒的包膜糖蛋白。包膜糖蛋白 跨膜蛋白,74,75,逆转录病毒生物学特征,在生命周期中，反转录和整合是必需的。具有高突变率和频繁重组的特点。病毒感染后可以潜伏很长时间。产生严重的疾病。,76,基于逆转录病毒的以上特性，逆转录病毒载体必须是复制缺陷型的载体。载体的构建是通过去除病毒基因组中的病毒基因，仅留下单一复制周期所必需的顺式作用元件（作为病毒蛋白的识别区域）。,77,典型逆转录病毒的顺式作用元件,基因组RNA逆转录：LTR,逆转录起始位点(pbs),聚嘌呤区(ppt)病毒DNA整合于染色体DNA：前病毒整合位点（att）前

28、病毒转录起始区及转录终止区：LTR 病毒RNA包装成子代病毒颗粒：壳体化位点（encapsidation site）,78,79,包装细胞产生重组的、复制缺陷型逆转录病毒颗粒的过程,80,逆转录病毒载体可以通过三种不同的方式获得。,第一种方式是重组病毒载体和野生型病毒DNA质粒结构在培养的细胞中共转染。当重组病毒载体和辅助病毒进入同一个细胞时，有复制能力的病毒提供基因产物，结果包含载体基因组的病毒颗粒产生。,81,82,第二种方式是重组病毒载体和表达病毒基因产物的质粒共转染（但不包括病毒繁殖所必需的顺式作用元件），从而使病毒载体仅完成繁殖的单一生命周期。,83,84,第三种方式是构建逆转录病毒

29、的包装细胞系，该细胞系表达载体繁殖所必需的病毒蛋白。这种包装细胞系极大的提高了病毒产物中含有载体基因组的病毒的含量。首先，这种方式是病毒产生的过程简化，比质粒共转染技术能更有效的产生高滴度的载体病毒颗粒。其次，使用包装细胞系降低了感染过程中辅助病毒和载体序列发生重组而产生野生型病毒的可能性。,85,包装细胞（pakaging cell）：包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因gag、pol、env所编码的蛋白，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA，一句话，包装细胞本身不能产生任何形式的病毒颗粒。,8

30、6,87,已经构建出为致癌性逆转录病毒载体包装的包装细胞系。因此致癌性逆转录病毒载体大多采用包装细胞系进行病毒载体的包装。由于慢病毒载体包装细胞系构建困难，因此慢病毒载体多采用第二种方式即重组病毒载体和表达病毒基因产物的质粒在辅助细胞中共转染进行病毒载体的包装。,88,病毒载体靶向性修饰,为了确定病毒载体的靶向性，对病毒的外膜糖蛋白进行修饰，重新决定其亲嗜性，从而更有效的感染靶细胞。将外源配体（如EPO、CD4序列，整合素配体等）与Env的N端融合构成杂合体外膜糖蛋白，使产生的病毒颗粒特异性的感染表达相应受体的靶细胞。将特异性的单链抗体与单嗜性病毒Env的N端融合，使产生的病毒颗粒特异性的感染

31、表达相应膜抗原的靶细胞。用水泡性口炎病毒G蛋白（VSV G）代替Env蛋白包装逆转录病毒核衣壳，构成假病毒，提高病毒感染能力。,89,致癌性逆转录病毒载体的特点,产生较高的病毒滴度：106-107PFU/ml。具有广泛的宿主范围：分裂期的细胞；整合于宿主细胞染色体中，使外源基因长期稳定表达。对宿主细胞的细胞毒性较低。外源基因的容量：10kb,90,致癌性逆转录病毒载体存在的问题,不能感染非分裂期细胞。随机整合可能导致靶细胞基因突变。存在通过同源重组产生具有复制能力的病毒的可能。病毒颗粒可被补体途径迅速降解。可能与人体内原型病毒发生重组。,91,慢病毒载体的特点,可以感染分裂期细胞也可以感染非分

32、裂期的细胞。带有水泡性口炎病毒G蛋白（VSV G）的假病毒宿主宿主细胞类型广泛。所获病毒滴度相对较高106-107PFU/ml。整合于宿主细胞染色体中，使外源基因长期稳定表达。外源基因的容量：10kb。,92,慢病毒载体存在的问题,HIV-1载体可能导致血清转换为HIV-1阳性。病毒调节蛋白（Tat、Rev等）的存在可能导致细胞功能失调。随机整合可能导致靶细胞基因突变。存在通过同源重组产生具有复制能力的病毒的可能。可能与人体内源性病毒发生重组。包装细胞系的构建在慢病毒系统比致癌性逆转录病毒系统困难。,93,逆转录病毒和慢病毒载体的应用,遗传性疾病的治疗 囊性纤维化病 色素性视网膜炎肿瘤的基因治疗：引入自杀基因，杀死肿瘤细胞。获得性免疫缺陷综合症的基因治疗。（慢病毒应用多）神经系统和造血系统疾病的基因治疗（慢病毒应用多）致癌性逆转录病毒载体在许多临床研究中使用受到限制因为它不能感染非分裂期细胞，例如造血干细胞、末端分化神经细胞、肿瘤细胞等研究中不能使用该载体。而慢病毒载体能够有效的感染非分裂期细胞和终末分化细胞。,94,95,96,97,98,谢谢,