《病毒免疫学》PPT课件.ppt

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1、病 毒 免 疫 学(硕士研究生用),授课教师:左 丽2008年4月1日,分子病毒学的概念,“分子病毒学”是一个广义的概念，即“分子水平上的病毒学”.是一门研究与病毒相关的蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸以及蛋白质与脂类之间的相互作用（包括病毒粒子的结构、病毒基因组的合成与表达、病毒对宿主细胞的影响等）的学科。两大任务:采用现代分子生物学技术，阐明病毒及病毒感染的本质;分子病毒学原理的应用.,主要研究内容:病毒的分子结构与功能、病毒感染的分子机制、基因表达调控原理、抗病毒多肽物质的研制、病毒转基因载体的研究、病毒蛋白质工程、病毒性疾病的诊断和新病毒的发现等。,第一节病毒学的历史与进化,病毒学的历史

2、一个世纪前，病毒已被作为一组独立的生物群体出现在人们与疾病抗争的历史记载中。在当时的条件下，人们无法对病原体进行科学的、系统的分类，然而病毒作为最简单的生命形式出现在人类活动史中已是无可争议的事实。,北宋年间（公元10世纪）我国就有了用人工免疫接种预防天花的记载。到11世纪，天花接种在中国和印度已很普遍。公元7世纪，这一技术传入中东，并很快扩展全欧洲,接种的死亡率达到2。但在18世纪天花导致的死亡人数占整体人群的25，婴孩死亡率高达40。18世纪90年代英国医生Edward Jenner发明了“种牛痘”的方法预防天花，由于其副作用小而很快取代了天花接种，并一直沿用至今。,1885年huts P

3、asteur制备出第一个减毒病毒疫苗狂犬病疫苗。它可以引起机体产生针对狂犬病毒有效的保护性免疫，却只引起轻微的症状。随着第一个病毒的发现，许多病毒疫苗如黄热病疫苗、流感疫苗等也被陆续发明。,二、病毒的发现,第一种病毒的发现1892年，俄国科学家Dimitri Iwanowski试图用无釉陶瓷滤膜过滤烟草花叶病的病原物质时失败了，却意外地发现其滤过液可以将疾病传到另外的植物.1898年，Martinus Beijerinck在对烟草花叶病进行详细研究后，提出烟草花叶病病原体不是一种微生物，而是一种具有传染性的可溶性分子，可在宿主细胞内复制。同时，Freidrich Ineffier也发现了口蹄疫

4、病原体相同的特性。,将这一类比细菌小、具有感染性和复制性的物质称作超滤病毒，后来简称为病毒（virus）。继烟草花叶病毒和口蹄疫病毒被发现以后，鸡白血病病毒和鸡实体瘤的病毒等 也陆续被发现。,人类病毒的确认,黄热病很早以来就在热带国家流行，死亡率很高，然而人们一直找不到黄热病的病原体。黄热病不直接传染，吸血昆虫（特别是蚊子）充当了该病的传播媒介。1901年，WalterReed和James Carroll将一个黄热病患者的血经过稀释和过滤后，注射到3个没有免疫力的志愿者体中，其中2人出现了黄热病的症状，从而证实了黄热病的病原体是可滤过的病毒。1909年发现了引起人类脊髓灰质炎的病原体脊髓灰质炎

5、病毒。,在接下来的几十年中，又有另外一些人类病毒被发现。但由于实验室病毒操作的危险性和困难以及实验方法的落后，病毒研究进展缓慢。典型的例子是流感病毒。流感引起的大瘟疫主宰人类历史超过100年，发生在1918年至1919年的流感夺去了超过两千万人的生命。但直到 1933年发现适合流感病毒扩增的宿主之后，才第一次分离出人流感病毒。,（三）噬菌体的发现,Frederick Twort和 Felix 分别于 1915年和1917年首先发现了感染细菌的病毒。因为它们能溶解琼脂平板上的细菌，Felix将之命名为噬菌体（bacteriophag s）。在随后的几十年中，病毒学家利用噬菌体作为研究模型，发现了

6、病毒的许多特征，包括病毒的结构、遗传、复制等。,三、病毒学研究方法的发展,病毒学的发展在很大程度上依赖于实验技术和实验体系的发展。活的宿主体系 起初的病毒学研究是建立在活的宿主体系之上的,植物病毒首先得以较深入地研究。最初的动物病毒研究也是采用活体动物进行的，Pasteur在研究狂犬病疫苗采用家兔;黄热病的研究主要采用老鼠作为实验对象，也有部分志愿者参加人体试验。甚至采用志愿者进行人类病毒的研究。,在上世纪初，鸡胚开始用于病毒的研究。它不仅是第一个繁殖培养病毒和高效分离病毒（特别是流感病毒和各种痘病毒）的体系，还是第一个定量分析动物病毒的体系。鸡胚的应用使病毒学研究出现了较大的进展，多种病毒也

7、因此被分离鉴定。,动物宿主体系至今仍应用于生产不能体外繁殖的病毒、研究病毒感染的病理作用、检测疫苗的安全性等。近年来，转基因动物或植物已用于研究病毒与宿主的相互作用。将病毒基因组插入生物体的 DNA中，使病毒蛋白质在转基因动物或植物中表达，可以在活的宿主体内研究单个或多个病毒蛋白的病理作用。随着转基因生物相关技术难点的解决，这种方法将得到越来越广泛的应用。,(二）组织培养技术,1943年，我国学者黄恢祥利用鸡胚组织块在试管内进行病毒传代、定量滴定及中和实验。1949年John 等在原代人体细胞中繁殖出脊髓灰质炎病毒，迎来了病毒学的黄金时期。借助于组织培养技术，病毒学家们在20世纪50年代到60

8、年代之间分离和鉴定了上百种对动物不敏感的新病毒（如腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、ECHO病毒和Coxsakie病毒等），还促进了病毒疫苗的研究。,（三）血清学免疫学方法,免疫学为病毒学的研究提供了许多技术方法。从1941年George Him观察到流感病毒能使红细胞发生凝集的现象后，红细胞凝集试验就开始用于病毒抗原类型和病毒制品效价的测定。另外，抗血清也被用来鉴定病毒的抗原类型和测定病毒效价。20世纪60年代以后，出现了一系列更灵敏、快速和准确的病毒检测方法，如互补固定测定法、放射免疫法、免疫荧光法、酶联免疫吸附分析（ELISA）、放射标记免疫共沉淀、蛋白质杂交分析（Wester

9、nblot）等.,(四)超微结构的研究,用物理学方法测量病毒粒子始于20世纪30年代。最早是用不同孔径的胶膜测定病毒粒子的直径，粗略估量了病毒粒子的大小。对病毒粒子较精确的测量是60年代使用超速离心机对病毒粒子沉降特性的研究。超速离心不仅可以测得病毒的沉降系数（反映病毒粒子中核酸和蛋白质的比率），离心得到的高浓度纯病毒制品又为病毒的化学组成分析提供了样品.分光光度计可以更简便地测定病毒的核酸蛋白比率和物理学性质；电泳技术则从蛋白质和核酸分子水平分析病毒粒子的组成。,X射线晶体衍射技术使在原子水平上测定病毒的结构成为可能，其前提是获得病毒结晶体。20世纪50年代，测定了烟草花叶病病毒郁金香黄花叶

10、病毒等植物病毒的粒子结构，发现了病毒粒子的两个基本结构：螺旋（helix）和二十面体形（icosahedron）。结构不规则的病毒不能形成结晶，无法通过X衍射法进行研究。这类病毒中很多尚未有高清晰的原子结构图（如 HIV等）。一些大的病毒粒子（如牛痘病毒）包含成百上千种蛋白质，也无法用X一射线晶体衍射技术进行分析。,近来，核磁共振越来越多地用于测量大分子（包括核酸和蛋白质）的原子结构，但这种技术只能分析一些相对较小的分子（上限为3040kD），无法分析完整的病毒颗粒。,化学分析方法,用于测量病毒的整体组分、病毒蛋白和核酸的特性，还用于测量病毒粒子的结构及包膜中各种组分之间相互作用的方式。通过对

11、TMV等病毒的分析，发现病毒是由蛋白质和核酸（DNA或RNA）组成的，从分子水平证实了病毒也具有生命的基本特征。通过加入化学试剂使病毒粒子组分一步步解离，可以得到许多关于病毒粒子的组成和装配的信息。确定使衣壳蛋白变性的试剂可以揭示各种病毒组分相互作用的基础（静电作用、疏水作用等）。,将病毒表面的蛋白质用某些化学元素进行标记，可以研究蛋白质的哪些部位暴露于表面，哪些部分被粒子或质膜包藏。用交联试剂或具有一定长度的“手臂”的新合成试剂可以测定病毒中相互作用的蛋白质和核酸的空间关系。这些方法还被用来研究病毒粒子表面抗原位点的改变或丢失，协助建立病毒粒子的物理结构图谱。,电子显微镜技术,1939年发表

12、了第一张病毒（TMV）的电镜照片。电子显微镜有两类：透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。在病毒结构的研究中，SEM可以得到美妙的三维外观图，而TEM可以实现更高的放大倍数。通过电子显微镜得到病毒的两个基本信息：病 毒粒子的数量以及病毒的三维外观和结构。由于许多细胞组分（如核糖体等）会干扰电镜的 观察，免疫电镜技术应运而生。,Watson和Crick的DNA双螺旋结构理论揭示了遗传物质的基本规律，分子生物学的发展极大地推动了分子病毒学的发展。20世纪60年代以来，DNA和RNA病毒的繁殖机制相继被阐明；亚病毒相继被发现；许多病毒的基因序列被测定；癌基因和抑癌基因被发现；某些病毒基

13、因结构与功能的关系、基因表达调控原理以及蛋白质分子结构被阐明。体外蛋白质合成和表达技术的应用;蛋白质与蛋白质之间相互作用的研究;生物芯片的应用及人类疾病蛋白组学的兴起等极大地促进了分子病毒学的发展。,病毒学发展史上的重大事件,1798接种牛痘预防天花 E Jenner1885制成狂犬疫苗 LPasteur1892发现烟草花叶病病原的滤过性 Iwanowski1898发现烟草花叶病的滤过性病原MW Beijerinck发现口蹄疫病原的滤过性 FLoefller等1907发现人类疣组织的无细胞超滤物可以在人与人之间传播 GCuiffO,1908发现鸡白血病病原可用无细胞滤液感染鸡来传代 VElle

14、rman等1909分离 Polio病毒 Landsteiner等1919发现 RSV P ROllS1915发现噬菌体FWTwoft1931用鸡胚进行病毒传代 GoodPasture等1933鉴定了兔乳头瘤病毒 REShoPe1934纯化噬菌体 MSchlesinger,1935获得TMV的结晶 W MStanley1937阐明了植物病毒的核壳体 FCBawden等1937研制出黄热病减毒活疫苗 MThener1938测定了各种病毒颗粒的大小 W JElford1939电镜下观察到TMV GAKausche等1940阐明了噬菌体的复制周期 M Delbruck1942发现了第一个哺乳动物RNA

15、肿瘤病毒（小鼠腺瘤病毒）JJBittner1949用单层细胞培养脊髓灰质炎病毒1JEnders等,1950阐明了溶原性噬菌体诱导的原理 A Lwoff等1951鉴定了一株引起小鼠白血病的病毒LGross1952证明一种噬菌体DNA具有感染性A DHwhs等1952揭示了TMV外壳蛋白的化学性质 HarriS1952发现转导现象 N DZinder等1952发现溶原性噬菌体 EWOllman等,1952利用细胞单层培养进行蚀斑试验1955制备脊髓灰质炎减毒活疫苗1955成功地将TMV的核酸及其蛋白亚单位重建出感染性的TMV HFraenkelConrat等1955获得脊髓灰质炎病毒的结晶FLSC

16、haffer等1956证明TMV RNA分子具有感染性 HFraenkelConrat等,1957成功地从MengO脑炎病毒颗粒内提取出感染性核酸 Colter1957发现干扰素 Isaacs等1957用细胞培养分离出多瘤病毒 Stewart等1958通过化学诱变获得TMV突变体 A Gierer等1960测定了TMV外壳蛋白的氨基酸序列A T等1962在体外翻译噬菌体RNA DNathans等1965成功地在体外复制叩噬菌体 RNA S Spiegelm。等,年份主要成就作者,1967阐明类病毒的本质 TODiener等1968揭示EBV与传染性单核细胞增多症及Burkitt淋巴瘤有关 G

17、Henle等1968阐明流感病毒的多节段RNA基因组PH Duesbe1970发现逆转录酶 M Temin等1973取得大鼠细胞遗传信息稳定转录到小鼠肉瘤病毒的证据 MScolnik等1976发现正常细胞中含有与RSV癌基因（SRC）相对应的基因 Dstehelin等,1977测定了aX174的DNA全序列 FSang6r 1977 研究腺病毒基因转录时发现剪接处 1978测定了SV40的全序列 WFiers，VBReddy 1978证明如CDNA具有感染性 TTanigUChi等 1978证明RNA肿瘤病毒转化基因SRC的产物是磷酸激酶 MSCOlett等 1979用载体成功地表达人干扰素基

18、因 TTaniguchi等,1979用载体成功地表达人干扰素基因 TTaniguchi等 1980发现一株与白血病相关的人类逆转录病毒 BPoiesz等 1980发现 HDV M Rizzetto 1982发现乙型肝炎病毒DNA复制中有逆转录过程 JSummers等 1982痘菌病毒作为载体表达外源基因 B MOss，E Paoletti 1982发现羊疾痒病病原体是朊病毒Prusiner,1983分离到与AIDS相关的人类逆转录病毒Montopier，RCGallo 1985利用逆转录病毒为载体将外源基因导人小鼠 Hvonder Patten等 1985阐明了鼻病毒的晶体结构MG Rossm

19、ann等 IWI将Moloney鼠白血病病毒反义序列导人受精卵，培育出抗病毒的细胞Han等转基因鼠.1997发现疯牛病的致病因子是朊病毒Slhasiner,第二节 病毒的定义与分类,病毒的定义随着分子病毒学的发展而不断更新。现在认为病毒是一种介于生命和非生命之间的一种物质形式，是一种比较原始的、有生命特征的名履自我复制和专性细胞内寄生的非细胞生物。,（一）病毒的起源 病毒的发生、进化乃至生命的起源，是生物学研究的一个重要课题。由于病毒特别小只有在电镜下放大几十万倍才能看到，加上病毒在漫长的演化史中没有“化石”或“遗体”可供研 究，所以病毒发生和进化的研究相当困难。我们只能通过研究同时代的病毒来

20、推测病毒的演化过程。,退化假说：认为病毒是由较高级的细胞内寄生生物退化形成的。受外界环境的影响，细胞内寄生生物逐 渐丢失大部分遗传物质，只保留了最基本的复制和维持寄生生活所必须的基因，不能自身繁 殖，必须依赖于宿主细胞才能完成基本的新陈代谢和繁殖。,“细胞来源假说：认为病毒是由细胞某些组分脱离了细胞的调控系统而自成体系形成的一组能在细胞内复制的生物，病毒基因组可能就是细胞染色体或线粒体的部分基因。第三种假说认为病毒是通过与细胞生物体平行的进化途径，由生命产生之前的RNA世界中的能自我复制的分子进化而来，并与细胞生物体共同进化。,（二）病毒进化的机制,病毒以最少的基因组合产生最大的多样性。病毒基

21、因突变（包括转换、插入、缺失、颠换。重组、重配等）和自然选择是病毒进化（virus evolution）的基础，也是病毒多样化的基础。,1基因突变是病毒进化的基础高频率的基因突变是病毒进化的基本条件 2病毒遗传信息的交换 3自然选择（natural selection）,1基因突变是病毒进化的基础高频率的基因突变是病毒进化的基本条件,多数RNA病毒基因组的复制是以RNA中间作为模板进行的，其复制错配率为1105-1/104，比宿主细胞高出一百万倍左右，一个10 kb的 RNA病毒基因组每复制一次就有可能产生一个基因突变。由于DNA聚合酶存在纠错功能，DNA病毒基因组复制产生的突变率明显低于RN

22、A病毒。,但在溶原性增殖时，DNA病毒基因组的突变率还是明显高于宿主细胞。例如，噬菌体以两种方式繁殖，一是整合到宿主基因组中通过宿主细胞酶系统进行复制，二是经病毒自身的酶体系进行溶原性增殖。第二种繁殖方式的突变率比第一种高20100倍。由于DNA病毒往往产生大量子代病毒，使得基因突变可能性增加，结果增加了DNA病毒的多样性。病毒的多样性是病毒生存和进化的首要条件。,2病毒遗传信息的交换,病毒之间可以通过基因组片段的重组（recombination）或重配reassortmen）交换遗传信息，这是病毒在自然选择过程中继续生存所必需的。两种或多种病毒同时感染一个宿主细胞为病毒之间遗传信息的交换提供

23、了机会。此外，病毒与细胞基因组之间也存在遗传信息的交换，许多病毒基因组中都存在与宿主高度同源的序列就是最好的证明。这种遗传信息的交换在病毒进化中扮演了一个重要角色。,3自然选择,能存在于自然界的完整病毒必须总是先于宿主进行适者生存的选择。病毒通过快速变异和产生大量子代病毒，提供丰富多样性的病毒以供自然选择。由于病毒遗传信息及结构简单，病毒通过选择宿主来适应变化的环境。病毒进化一般具有两条途径。一是病毒与其宿主共同进化，二者具有共同的命运。这样，病毒将面临生存的瓶颈病毒可能因为宿主的消亡或因抗病毒措施的应用而消亡；,二是病毒选择多种宿主，从而具有较广阔的小生境。当一种宿主面临危险时，病毒可以在另

24、一种宿主中繁殖。一般DNA病毒进化依照第一条途径，而大多数RNA病毒的进化通过第二种途径。这两种途径都为病毒提供了最佳的生存方式。,（三）病毒进化的特点,1病毒进化比一般生物快得多，病毒的基因变异表现出一定的“量子”特征。首先，病毒基因突变的频率比其他生物高10n倍；其次，病毒的繁殖也是以10n倍的速度进行的，大量增殖加速了病毒的变异。病毒实际上是以大致相同、但略有差异的一群病毒粒子的形式存在，也就是以居群（PoPulation）或者准种（quasisPecie s）的形式存在于宿主体内，而不是以均一的形式存在。这一点对于认识病毒的存在形式，探讨病毒遗传、变异和进化具有重要意义。,2新病毒基本

25、上是从另一种宿主的病毒演化而来。“旧”病毒通过跨宿主转移的方式进化可以较为高效地扩大病毒的多样性，比重新产生一个新病毒容易，也有利于病毒在更广泛的宿主环境中进行数量和种类的扩增。,3新病毒或跨越宿主后的“旧”病毒在新的宿主中以较快的速度分化变异，充分增加其多样性。4由于自然选择的原因，新病毒稳定后其毒力大多处于中等水平。因为病毒毒力太强会造成宿主和病毒的共同灭亡，不利于宿主和病毒的共同进化和双方多样性的发展。弱毒株虽不能对宿主造成损伤，但不能产生大量病毒，不利于病毒多样性增长。而中等毒力的病毒株既能保持一定的病毒数量，又能在宿主中不断传代下去，因而呈现出选择优势。,5病毒的进化有一定的随机性，

26、并受自然选择的压力而呈现一定的方向性和稳定性。病毒以各种方式随机地产生变异，但随机产物还要经过病毒活性以及病毒与宿主相互关系的选择.。此外，病毒各个基因以及基因的各个部分具有不同的进化特征。例如，在流感病毒中，编码外壳蛋白的基因进化较快，而编码内部蛋白的基因却相当保守；在编码血凝素蛋白的基因中，与宿主免疫有关的部分变异较快，而与细胞粘附有关的部分相对稳定。,迄今为止，对病毒的起源、进化及病毒与宿主群体的相互作用仍然知之甚少。唯一可以肯定的是，病毒快速增殖出数目庞大的子代病毒、通过变异产生巨大的遗传多样性以及对变化莫测的环境的惊人的适应能力构成了病毒的生存和进化的本质。分子生物学和比较生物学的发

27、展，使能通过DNA序列分析比较病毒基因的多样化，探讨病毒起源和进化途径。,三、病毒的分类,（一）病毒分类概况 病毒的发现已有近百年，而病毒分类学的历史则较短,有别于细菌和其他生物的分类法.病毒采用一种非系统、多原则、分等级的分类法。依据有：1 基因组性质与结构；2 衣壳对称性；3 有无包膜;4 病毒粒子的大小、形状;5 对理化因素的敏感性;6病毒脂类、碳水化合物、结构蛋白和非结构蛋白的特征；7抗原性；8 生物学特性（增殖方式、宿主范围、传播途径和致病性）。,国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）大约每隔3年发

28、布一次新的病毒分类命名系统。,ICTV1995年公布了病毒分类和命名第六次报告，将现在已知的四千多种病毒分为 49个科，11个亚科，164个属（包括 22个未定科的属），其中植物病毒分类不再采用组（group）和亚组(Supgroup），统一使用科、属、种分类单元。,经适当的修改和调整，共设3个目,62个科。其中3个目分别为有尾噬菌体目（Caudovirales）（包括3个科、15个暂定属）、单分子负链RNA病毒目（Mononegavirales）（包括4个科、2个亚科、12个属和2个暂定属）和套病毒目（Nidovirales）（包括2个科、3个属）。将类病毒（viroids）、卫星（sate

29、llites）和朊病毒（prions）归为亚病毒感染因子（subvirial agents）。,在2001年ICTV公布的病毒分类和命名第七次报告中病毒分类系统达到了3个目、66个科（包括2个类病毒科）、9个亚科和244个属（包括32个暂定属和7个类病毒属）。随着病毒学研究的不断深入，特别是基因和基因组研究的推进，病毒的分类命名方法也将不断向前发展。,（二）病毒分类和命名的原则,本书采用 ICTV 2001年公布的病毒分类和命名第七次报告的病毒分类系统，其主要的分类和命名原则如下：1国际病毒分类系统采用目（order）、科（family）、亚科（subfamily）、属（genus）、种（sp

30、ecies）分类单元（包括植物病毒在内），但是亚病毒感染因子（卫星和朊病毒）采用任意分类。,2病毒种是指具有多原则分类（Polythetic class）特性、构成一个复制谱系（replicating lineage）、拥有一个特定小生境的一组病毒。种名由几个有实际意义的词组成。3属是一群具有某些共同特性的种。4亚科是一群具有某些共同特性的属。亚科只在需要解决复杂分类问题时才使用。5科是一群具有某些共同特性的属或亚科。,6目是一群具有某些共同特性的科。7属、亚科、科、目均用单词，它们的后缀分别为“-virus”、“-virinea”、“-viridea及“-virales”。8有关病毒分类的规

31、则也适用于类病毒，类病毒的科、亚科、属名的后缀分别为“-viroidae”、“-viroinae”和“-viroid”。,9病毒目、科、亚科和属的接受名（accepted name）一律用斜体，第一个字母大写；种名用斜体，首词第一个字母大写，其他词（除专有名词）一律小写。10种以下的血清型、基因型、毒株、变异株和分离株的名称由国际专家小组确定。,参考文献,l.Baltimore D Expression Of animal virus genomes Bacterial Rev.1971，35：2352412,Ebert D Experimental evolution of parasitesScience，1998，282：142314353Lois C，Hong EJ，Pease S，et alGermline transmission and tissuespecific expressi of transgenes delivered by lentiviral vectorsScience 2002，295：868：872,