《生物芯片原理》PPT课件.ppt

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1、生物芯片原理 principle of biochip,医学院病毒所,本章提纲,生物芯片简介生物芯片的分类基因芯片基本原理、流程与应用蛋白质芯片及应用,第一节 生物芯片简介,一、什么是生物芯片 生物芯片主要指通过平面微细加工技术，在固体芯片等载体上的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测,芯片上每平方厘米可密集排列成千上万个生物分子，能快速准确地检测细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分，并获取样品中的有关信息，其效率是传统检测方法的成百上千倍。,生物芯片分析过程,基因芯片的最大优点在于其高通量。传统方法检测众多基因要经历多次实验而且自动化程度

2、低，因而每次实验之间是存在系统误差的。基因芯片可以克服这个缺点，众多基因的探针的标记、杂交等过程是在一次实验过程中完成的，而且自动化程度高，数据客观可靠,1996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片，并制作出相应的芯片系统。此外，美国的Hyseq公司、Aurora公司、Nanogen公司、Incyte公司等也在积极开展DNA芯片研究工作。近二年，摩托罗拉、惠普、IBM等跨国公司也相继投以巨资加入生物芯片的研究开发。,我国是从一九九七年开始对生物芯片研究。中国医药生物技术协会生物芯片分会2006年在北京成立。中国在北京、上海、陕西、天津、南京建

3、立了五大生物芯片研发和产业化基地。我国生物芯片产业尚未形成统一的技术标准，不规范。在产品认证认可方面也存在与国际惯例不接轨的情况。,生物芯片技术是20世纪90年代以来，影响最为深远的重大科技进展。它是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。,发展趋势,缩微芯片实验室 生物芯片研究领域的一个热点，它是将传统的生物化学样品制备、生化反应、检测三个步骤集于一体，缩小构成芯片上的实验室系统,第二节 生物芯片的分类,一般分类,信息生物芯片和功能生物芯片,第三节基因芯片的基本原理与流程,基因芯片技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高

4、密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及检测等研究的技术。,基因芯片发展历史,Southern and Northern Blot,Dot Blot,Macroarray,Macroarray,RNA,DNA1,DNA2,Probe,Southernhybridization,Northernhybridization,Hybridization of Nucleic Acids,Synthesizingoligonucleotide,PROBE GGGGACGAGTCC

5、TCCGTTCT,The nucleic acid sequence isDeduced from amino acid sequence,Chemical synthesis,Preparation of Traditional Nucleic Acid Probe,基因芯片分类,按芯片制备方法分类 原位合成芯片（synthetic genechip）DNA微阵列芯片（DNA microarray）按探针分类 寡核苷酸阵列 DNA阵列 基因芯片 cDNA芯片 RNA芯片,Types of DNA Chips,生物芯片的原理,生物芯片利用空间位置固定事先已知的核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物分子

6、芯片技术对固定相分子的要求较高，要求生物分子固定在芯片基质上之后仍要保持生物活性的稳定。在分子杂交反应和洗片等处理过程中能稳定结合所亲和的分子，防止其在杂交洗涤过程中被冲洗掉，保证检测信息的准确可靠。,制作芯片片基的材料首先必须有很好的光学性质，能利用光进行透射和反射的检测芯片表面具有可以进行化学反应的活性基团，方便生物分子的偶联而固定芯片表面的活性化学基团有足够的吸附能力，要能结合最佳容量的生物分子芯片要有很好的稳定性，具有一定的抗压能力，并且在生物分子杂交反应过程中要处于惰性状态，不会发生其他化学反应或其他物质吸附生物芯片要有很好的兼容性，可以广泛应用于生物学检测和研究,芯片片基,生物分子

7、与芯片的结合,生物芯片表面的活性基团形成特异亲和生物分子的位点，用来吸附和固定生物活性分子，例如多肽、核酸、酶、抗体或抗原等根据芯片基片表面的活性基团的类型，芯片可以分为氨基片、醛基片、环氧乙基片和N一羟基琥珀酰亚胺酯片根据不同的需要来选用芯片，如对大分子DNA的吸附要用氨基片，对寡聚核苷梭或小片段DNA要用醛基片,a.氨基片 表面为氨基，直接与核酸分子的磷酸基团靠电荷作用相结合b.醛基片 表面的醛基直接与生物分子的氨基共价结合,c.环氧已基片 表面的环氧已基直接与生物分子的氨基共价结合；d.N-羟基琥珀酰亚胺酯片 表面的N-羟基琥珀酰亚胺酯基直接与生物分子的氨基共价结合。,DNA Chip

8、Technology,Solid support.glass,plastic,metal,silicon.Miniaturized array of DNA(genetic material)Work on the biochemical principle of DNA/DNA hybridizationHybridized probes(DNA molecules)are fluorescently labeled,Comparison of DNA Chip Technologies,Sensitivity of DNA chip assaysProbe and target DNA/R

9、NA ComplexityChip surface(autofluorescence and non-spec.bkg)Attachment chemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)Hybridization efficiency(lots of factors)Detection technology(signal type,efficiency,noise),Oligo-Chip cDNA-Chip Genomic Chip 8 n or 20 n 50,000 n,sequencing,expression,expression,ge

10、nomic analysis,基因芯片的原理,依据双螺旋原理，核酸分子杂交技术，在靶标样品与探针之间进行选择性反应，将反应一方，探针固定在芯片上，另一方，荧光标记制备好的cDNA，分别标记绿色的Cy3和红色的Cy5通过流路或加至芯片上。,基 因 芯 片 流 程,样品制备,芯片制备,杂交,杂交信号检测,数据分析,Each spot contains known DNA,Complementary DNA hybridize,Signal appears,Biochip Based on Hybridization,实验流程,影响杂交反应的因素 1 探针浓度 其浓度差异对信号有影响，浓度高信号强。

11、2 阳离子 阳离子存在可提高异源杂交双链的生成速度。3 温度 ONA2542C，cDNA 5570 C 4 序列组成 芯片上一次产生上万个异源杂交反应，应选择最协调条件。5 高灵敏度监测系统，阅读仪。,基因芯片检测原理,荧光扫描成像用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；而不完全杂交的分子热力学稳定性低，荧光信号弱；不杂交的无荧光。不同位点的信号被扫描后由计算机软件处理，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。,基因芯片数据分析,图像分析，Ratio值分析，基因聚类分析 图像分析 激光扫描仪得到的扫描图像文件通过划格，确定杂交斑点的位置，然后经过过滤背景噪

12、音，提取得到荧光信号强度值，最后以数据列表的形式输出。这一系列的工作都是依靠软件来完成，如Biodiscovery，Imagene 7.0分析软件。,Ratio值分析 在常用的双色荧光芯片系统下，各杂交斑点的两色荧光cy3cy5的比值又称R/G值。一般认为RG值在0.52.0范围内的基因不存在显著表达差异，该范围之外则认为基因的表达出现显著改变。由于实验条件的不同，该域值范围会根据置信区间进行调整。处理后得到的信息可以根据需要以各种形式输出，如柱形图、饼形图、点图、原始匡像拼图等。将每个信号斑点的所有相关信息如位标、基因名称、克隆号、PCR结果、信号强度、Ratio值等自动关联并根据需要筛选数

13、据。,聚类分析 clustering analysis 从生物芯片的图像分析中可得到大量的数据，要从中提取所需要的信息就必须对这些数据的统计分析。通过建立各种数学模型，分析芯片图像数据的生物学意义。聚类分析是利用大量相关数据对事物进行分类处理，其方法为直接比较样本中各种特征数据，将特征相近的归为一类，差别较大的归为不同的类。,四 生物芯片的制作,基本方法 点样法和原位合成法 原位合成法 原位光刻合成 压电打印法,点样法 这一方法相对技术要求不高，是最常用的方法。点样法是将预先合成好的探针、PCR产物、蛋白或多肽、抗原或抗体等经纯化、定量分析后，通过由阵列复制器或阵列点样机准确、快速地将不同探针

14、样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或玻片等相应位置上，再进行固定处理，如紫外线交联固定。,点样的方式分接触式点样与非接触式点样两种。接触式点样是点样针直接与固相支持物表面接触，将生物分子样品留在固相支持物上。非接触式点样以压电原理将样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。打印法的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打印2 500个探针；缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。,原位合成法,原位合成法 该方法技术比较复杂，除了Affymetrix 等少数实力雄厚的生物芯片公司可以用该技术外，其他的公司和实验室都是采用点样法制作芯片。原位合成方法有两种途径，一种是原位光刻合成，该技术是由

15、Affymerix公司的Fodor实验室开发。该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的多肽或寡聚核苷酸阵列。,另一种原位合成是压电打印法，主要用于合成寡聚核苷酸探针，其原理与普通的彩色喷墨打印机相似，所用技术为常规的固相合成方法。根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置，冲洗、去保护、偶联等与一般的固相合成技术相同。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，不需要特殊制备的化学试剂，可以合成出长度为4050个碱基的探针。,一个实例,基因芯片筛选宫颈癌相关基因的研究摘要 本研究中采用细胞原癌、抑癌基因分类芯片对原发性宫颈癌标本进行分析，以期探讨宫颈癌基因组中

16、存在的癌基因表达的变异，确定与宫颈癌相关的候选原癌或抑癌基因，为宫颈癌的诊断和治疗提供新的线索和依据。,实验结果,1 组织总RNA制备 本实验中共收集到宫颈癌组织0.96g，正常对照宫颈组织0.56g，分别提取总RNA。两种宫颈组织的总RNA提取的质量见表1 表1 总RNA提取结果样品类型 编号 总RNA量 OD260 OD280 OD260/OD280 荧光标记正常宫颈组织 N 706.8g 0.592 0.289 2.059 Cy3 对照组宫颈癌组织 C 1200.0g 1.015 0.488 2.114 Cy5 实验组,芯片扫描结果,Cy3 Cy5,宫颈组织/对照组织双色荧光标记芯片扫描

17、叠加图,图中X轴、Y轴分别以cy3荧光强度值(前景值背景值)和 cy5荧光强度值为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号；数据点若为红色，则代表Y值与X值的比值在0.5至2.0之间，属非差异表达；数据点若为黄色，则代表Y值与X值的比值在0.5到2.0范围之外，表明所代表的基因存在表达差异。,通过对基因芯片结果的分析，发现BLACP，bladder cancer related protein基因即膀胱癌相关蛋白基因的表达下调最为明显，提示BLACP基因与宫颈癌之间存在着联系。很可能是一个宫颈癌相关的候选抑癌基因。该基因在包括人在内的多种动物中已有发现。尚未发现与人类其它的基因有任何的

18、同源性。鉴于此，在本实验中BLACP 基因克隆到真核表达载体上，转染宫颈癌细胞系HeLa，发现它的确可以抑制HeLa细胞的生长及增殖。,Genomic chip,Screen specimens to determine gene copy number changesEstablish correlations between gene copy number changes and disease biologyDetermine the interaction of multiple genes on the initiation and progression of diseaseAc

19、celerate development of products for genomic disease management to guide therapeutic interventionCombined with expression chips,gives full understanding of disease process,三、芯片技术的应用,1 基因表达分析 分析基因表达时空特征 检测基因差异表达 发现新基因 大规模测序,DNA序列测定 人类基因组计划 鉴别和测定人类基因的DNA序列,杂交测序 sequencing by hybridization,SBH 建立在特定序列的

20、DNA与特定长度的寡核苷酸集合的杂交的基础之上。未知DNA序列可以通过鉴定与靶DNA序列形成完整的双链体寡核苷酸的重叠区域来确定；65536个八核苷酸点阵可测定约200个核苷酸的序列；一百万个十二核苷酸点阵可测定约1000个碱基对。,2 基因型、基因突变和多态性分析 分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系 3 疾病的诊断与治疗 遗传病相关基因的定位，产前筛查与诊断 肿瘤诊断 感染性疾病的诊断 基因突变检测与遗传病和肿瘤诊断的大量 平行测定,4.药物研究中的应用 新药开发 发现药物的新功能 调查药物处理细胞后基因的表达情况 对药物进行毒性评价 在基因水平上寻找药物靶标，毒性对 基因的影响。,其它

21、病原体的检出肿瘤相关基因表达谱 位点突变 耐药基因检测 疾病的分子分型 HLA分型,基因芯片的缺点 不能对待检测基因在组织中的精确定位进行判断。另外很多蛋白质功能不是主要依赖是否表达或表达量高低，而是依赖蛋白质磷酸化/去磷酸化等方式。在这种情况下，用核酸类生物芯片就没有什么意义，蛋白类芯片可能会有所作为。不能盲目崇拜高精尖端的技术和仪器设备。实事求是，定位明确，按规律办事。,生物芯片的未来,您只需提供保存完好的组织或细胞标本，公司的芯片技术服务人员就可替您完成实验操作与数据分析，向您提供由您所选的任何一个芯片的实验结果，可以为您节省大量的时间与精力。客户样品RNA抽提RNA质量检测cDNA模板

22、制备实时定量PCR芯片数据处理提供实验报告,细胞凋亡PCR芯片细胞周期PCR芯片血管生成PCR芯片肿瘤转移PCR芯片癌通路发现者PCR芯片DNA损伤信号通路PCR芯片氧化应激与抗氧化PCR芯片应激和毒性通路发现者PCR芯片肿瘤药物耐受和代谢PCR芯片细胞因子PCR芯片,乳腺癌和雌激素受体信号通路PCR芯片药物代谢PCR芯片内皮细胞生物学功能研究PCR芯片骨再生PCR芯片干细胞PCR芯片动脉粥样硬化PCR芯片糖尿病PCR芯片趋化因子与受体PCR芯片,生长因子PCR芯片炎症细胞因子与受体PCR芯片干扰素及其受体PCR芯片Th1-Th2-Th3PCR芯片Toll样蛋白受体信号转导PCR芯片细胞外基质

23、与粘连分子PCR芯片神经营养素与受体PCR芯片低氧信号通路PCR芯片,胰岛素信号通路PCR芯片JAK/STAT信号通路PCR芯片MAPK信号转导通路PCR芯片NF-kB信号通路PCR芯片一氧化氮PCR芯片Notch信号通路PCR芯片信号转导通路发现者PCR芯片TGFb/BMP信号通路PCR芯片TNF配体及受体PCR芯片Wnt信号通路PCR芯片管家PCR芯片,第四节 蛋白质芯片及应用,蛋白质芯片 是指以蛋白质分子作为配基，将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列，用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分

24、子之间的相互作用关系。又称为蛋白质阵列或蛋白质微阵列（protein microarray）,根据其固定生物分子的不同，可以分为受体配体检测芯片，抗原芯片，抗体芯片根据芯片载体的不同，分为普通玻璃载玻片，多孔凝胶覆盖芯片和微孔芯片3种主要形式。普遍应用的是玻璃片，另外也可以应用PVDF膜，聚丙烯酰氨凝胶，硝化纤维素膜，聚苯乙烯微珠，磁性微珠等,蛋白质芯片的分类,蛋白质检测芯片,蛋白质功能芯片,与基因芯片的比较,蛋白质是基因表达的最终产物,接近生命活动的物质层面 探针蛋白特异性高、亲和力强,可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料，血样、尿样、细胞及组织等进行检测适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合

25、物有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用,蛋白质芯片技术的原理,蛋白质芯片技术主要包括四个基本要点芯片阵列的构建样品的制备芯片生化反应信号检测及分析,提出生物学问题（实验目的）,样品预处理（重组蛋白，制备一、二级抗体，荧光标记）,生化反应化学偶合，加底物，反应温度和时间，冲洗条件,检测（荧光和比色扫描或拍照，参数设置）,数据分析和建模 图象量化，标准化建立模型）,1,2,3,4,5,蛋白质芯片制备,6,首先将蛋白按设计的阵列方式点印在介质上，样品蛋白质与芯片反应，然后用经过可以是酶、荧光、同位素、生物素等标记的蛋白质与芯片-蛋白质复合物结合，通过激光共聚焦显微镜和CCD照相机对标记信

26、号进行扫描分析,蛋白质芯片的核心技术是蛋白芯片的制备和反应信号的检测分析。因此蛋白质的纯度,蛋白质的固定是蛋白质芯片技术的重点和难点。由于蛋白质分子的活性依赖于不同的折叠方式，因此对芯片的表面修饰至关重要，要保证被点在芯片上的蛋白质不失活而又能牢固的固定在芯片上。,对最普遍应用的玻璃片而言，用于制备蛋白质芯片的方法主要有戊二醛修饰法、聚赖氨酸修饰法、巯基修饰法和多糖修饰法等,面临的问题,成本过高,需一系列昂贵的尖端仪器，芯片的标准化问题，提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等,Protein chip的应用,Diagnostic immunoassay simultaneous high-throughput analysis of known auto-antigens.Protein-Protein Interaction.DNA-Protein Interaction,Protein chip的应用,微生物感染病原体抗原、抗体的检测 自身抗体的检测 特定蛋白的检测 HLA分型 过敏原检测 肿瘤标志的检出,结语新技术的启示,“自强”语出周易“天行健、君子以自强不息”。“求是”语出汉书“修学好古，实事求是”。“拓新”意为创新，不断进取。,Thank you!,