《生物工艺学》PPT课件.ppt

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1、第二章 菌种来源，生物活性物质的筛选和菌种保藏,第一节 菌种来源,微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性,有些微生物能在厌氧的条件下生长,有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长,有些微生物能进行复杂的代谢,有些微生物能利用较复杂的化合物,有些微生物能在极端的环境下生长,二：工业化菌种的要求,能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物,有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强,遗传性能要相对稳定,不易感染它种微生物或噬菌体,产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）,生产特性要符合工艺要求,一、工业生产常用的微生物*从自

2、然界中分离出来就能被利用；对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。使用重组DNA技术改造的菌株目前育种总趋势 从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。,工业生产常用的微生物,菌种来源,工业菌种种类？产物？,由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类（alga）、病毒（virus）等也正在逐步地变为工业生产用的生物。尽管如此，目前人们对微生物的认识还是十分不够的。已经初步研究的不超过自然界微生物总量的10%左右。微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种，而大规模生产的不超过一百多种；微生物酶有近千种，而在工业上利用的不过四五十种。可见潜力是很大的

3、。在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌。,工业生产常用的细菌有 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)乳酸杆菌(Lactobacillus lactics)醋酸杆菌(Acetobacter)棒状杆菌(Corynebacterium)短杆菌(Brevibacterium)用于生产：生产淀粉酶(amylase）蛋白酶（proteinase）乳酸(lactic acid)醋酸(acetic acid)氨基酸(amino acid)肌苷酸(inosinic acid),细菌（bacteria）：属于单细胞原核生物（unicellular prokaryote），以典型的

4、二分分裂(binary)方式繁殖。细胞生长时，环状染色体（chromosome）被复制，细胞内的蛋白质等组分同时增加一倍，然后在细胞中部产生一横段间隔，染色体被分开，继而间隔分裂形成两个相同的子细胞。如间隔不完全分裂就形成链状细胞。,1、常用的细菌,大肠杆菌 应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。,乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作,乳杆菌属乳酸杆菌科，因发酵糖产生大量乳酸而命名。存在广泛。嗜酸性，最适ph5.56.0,ph3.04.5仍能生存，在无芽胞杆菌中其耐酸力最强。肠道乳酸杆菌可分解糖产酸，抑制致病菌及腐败菌的繁殖，乳酶生即由活的乳酸杆菌制成，可

5、治疗消化及腹泻。酸牛奶中的乳酸杆菌也有抑制肠道致病菌的作用。龋齿活动状态与唾液乳酸液杆菌计数之间有明确的相互关系。,枯草芽孢杆菌应用：-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5-核苷酸酶的菌种。,枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.70.823微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中

6、应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。,酵母菌（yeast）酵母菌为单细胞真核生物（unicellular eukaryote），在自然界 中普遍存在，主要分布于含糖质较多的的酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜（nectar）和植物叶子上，以及果园土壤中。石油酵母（petroleum yeast）较多地分布在油田周围的土壤中。酵母菌大多为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。母细胞体积长到一定程度时就开始发芽。芽长大的同时母细胞缩小，在母子细胞间形成隔膜，最后形成同样大小的两个细胞。如果子芽不与母细胞脱离就形成

7、链状细胞，称为假菌丝(pseudomycelium)。工业上用的酵母菌有：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida)、类酵母(Saccharomycodes)等，用于酿酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（lipase），以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。,真核细胞结构示意图,种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面包酵母 应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪,啤酒酵母,红酵母,啤酒酵母是啤酒生产上常用的典型的上面发酵酵母。菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用和饲料酵母，还可以从其中提

8、取细胞色素C、核酸、谷胱甘肽、凝血质、辅酶A和三磷酸腺苷等。,最常提到的酵母酿酒酵母（也称面包酵母）(Saccharomyces cerevisiae)，自从几千年前人类就用其发酵面包和酒类，在酦酵面包和馒头的过程中面团中会放出二氧化碳。因酵母属于简单的单细胞真核生物，易于培养，且生长迅速，被广泛用于现代生物学研究中。如酿酒酵母作为重要的模式生物，也是遗传学和分子生物学的重要研究材料。,面包酵母,含蛋白质50左右，氨基酸含量高，富含B族维生素，还有丰富的酶系和多种经济价值很高的生理活性物质。几千年前人类就用面包酵母发酵面包和酒类，在现代食品工业方面，广泛用作人类主食面包、馒头、包子、饼干糕点等

9、食品的优良发酵剂和营养剂。低糖酵母发酵时，面团一般含糖量7左右，高糖酵母发酵时含糖量则为16。安琪酵母股份有限公司是专业生产面包酵母的公司，产品涵盖所有的面包酵母产品类型，安琪牌活性干酵母（低糖型、高糖型）出口全世界80多个国家,霉菌（mould）霉菌不是一个分类学上的名词。凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌(fungi)统称为霉菌。霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处。它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性(aerobiotic)，多腐生，少数寄生。霉菌的繁殖能力很强，它以无性孢子和有性孢子进行繁殖，大多以无性孢子繁殖为主。,生长方式是菌丝末端的伸长和顶端

10、分支，彼此交错呈网状。菌丝的长度即受遗传性的控制，又受环境的影响，其分支数量取决于环境条件。菌丝或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。工业上常用的霉菌有：藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等；产品：酶制剂（enzyme preparation）、抗生素(antibiotic)、有机酸（organic acid）及甾体激素（steroid hormone）等。,曲霉属其中以黄曲霉具有很强毒性。绿色和黑色的具有很强的酶活性，在食品发酵中广泛用于制酱、酿酒。现代发酵工业中用于生产葡萄糖氧化酶、糖化酶和蛋白酶等酶制剂。其他菌株有：黄曲霉（A.flavus），烟曲霉（A.fu

11、migatus），灰绿曲霉（A.glaucus），构巢曲霉（A.nidurans），寄生曲霉（A.parasiticus），土曲霉（A.terreus）和杂色曲霉（A.versicolor）等。,应用：酱油、酱类（淀粉酶）产生黄曲霉毒素，不仅能引起禽畜中毒致死，亦有致癌作用。,米曲霉应用：米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。主要用于酿酒制曲和酱油制曲。,应用：生产甲义丁二酸,毛霉应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作。毛霉的用途很广，常出现在酒药中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我国多用来做豆腐乳、豆

12、豉。许多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等，有的毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。常用的毛霉主要有鲁氏毛霉和总状毛霉。,根霉种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉应用：酿酒,根霉在自然界分布很广，用途广泛，其淀粉酶活性很强，是酿造工业中常用糖化菌。我国最早利用根霉糖化淀粉（即阿明诺法）生产酒精。根霉能生产延胡索酸、乳酸等有机酸，还能产生芳香性的酯类物质。根霉亦是转化甾族化合物的重要菌类。与生物技术关系密切的根霉主要有黑根霉、华根霉和米根霉。,黑根霉，也叫面包霉。常寄生在面包和日常食品上，或混杂于培养基中，瓜果蔬菜等在运输和贮藏中的腐烂及甘薯的软腐都与其有关，菌丝体分泌出果胶酶，分解寄主的

13、细胞壁，感染部位很快会腐烂形成黑斑。黑根霉(ATCC6227b)是目前发酵工业上常使用的微生物菌种。,青霉菌,有些种类如点青霉（P.notatum）和黄青霉（P.chrysogenum）等可提取青霉素，药用青霉素又称盘尼西林。灰黄青霉（P.griseofulvum）等可提取灰黄霉素。,应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶,放线菌(Actinomycetes)放线菌因菌落呈放线状而得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中较广。大多腐生，少数寄生。放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。后一种繁殖方式见于液体沉没培养（submerged cultur

14、es）中。其生长方式是菌丝末端伸长和分支，彼此交错成网状结构，成为菌丝体。菌丝长度即受遗传性的控制，又与环境相关。,种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素。今年发现一些抗肿瘤抗病毒的抗生素。还是氨基酸、维生素、酶和酶的抑制剂/除草剂/抗寄生虫等药物的重要来源。,在液体沉没培养中由于搅拌器（agitator）的剪应力作用，常常形成短的分支旺盛的菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。它的最大经济价值在于能产生多种抗生素（antibiotics）。从微生物中发现的抗生素，有60%以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素

15、等。常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。,放线菌的分离,土样的采取？游动放线菌小单孢菌嗜热放线菌嗜盐放线菌,其他生物：A:担子菌（Basidiomycetes）：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类(mushroom)生物。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)药物的开发。近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中的“1，2-葡萄糖苷酶”及两种糖类物质具有抗癌作用。,B：病毒(virus)其特点如下：1.形体微小，体积比细菌小的多。2.没有细胞结构，是一种独特分

16、子的生物，主要由核酸和蛋白质构成。3.营寄生生活，由于缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专一性。,人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）,噬菌体（phage）是病毒的一种。：烈性噬菌体和温和噬菌体概念与区别。噬菌体在寄主细胞中的生长繁殖过程可分为吸附、浸入、增殖、成熟和释放。,C：藻类（alga）：培养螺旋藻，按干重计算每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才可获4吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28倍。培养珊列藻，从蛋白质产率计

17、算，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20-35倍。此外，还可通过藻类将CO转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重得5%-50%,合成的油与重油相同，加工后可转变汽油、煤油、和其他产品。有的国家已建立培植单胞藻的农场，每年每公顷地培植的单胞藻按5%干物质为碳水化合物（石油）计算，可得60吨石油燃料。此项技术的应用，还可减轻因工业生产而大量排放CO造成的温室效应。国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。,藻 类 工 厂,放线菌（链霉素四环素；红霉素等）,真菌（青霉素、头孢等）,一些产芽孢的细菌,植物或动物来源,一、抗生素生产有关的微生物

18、,抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：,第二节 已工业化产品生产菌的介绍,二、氨基酸生产有关的微生物,代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。,50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：,HD:高丝氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制,HT:高丝氨酸转乙酰酶,AK:天冬氨酸激酶,氨基酸生产菌的要求：,代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单,谷氨酸发酵的菌种：,其它氨基酸生产菌：,棒杆菌

19、属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌,常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌,三、食品酶制剂生产有关的微生物,开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。,淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌,三、常用的基因表达系统,(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌,生长迅速、蛋白产量高;,表达蛋白的纯化、分离及分析快速；,外源基因的导入相对容易；,已建立了整套表达理论及技术.,(二)真核细胞表达系统,酵母(既是微生物又

20、是真核细胞),生长迅速，营养要求不高，易培养；,安全性好；,比哺乳动物细胞操作简单；,具有一定的修饰蛋白的能力。,中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统,具有准确的转录后修饰功能；,具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；,具有重组基因的高效扩增和表达能力；,具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；,CHO很少分泌自身的内源蛋白。,微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。,问题：,生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？,礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有

21、潜力的新抗生素。,例：,第三节 自然界中有目的微生物分离的原则,一、菌种分离的一般过程,土样的采取,预处理,培养,菌落的选择,产品的鉴定,如何使样品中所含微生物的可能性大,如何在后续的操作中使这种可能性实现,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题：,在筛选所需的菌种时应考虑的一些重要的指标：（1）菌种的营养特征：（2）菌种的生长温度：（3）菌种对所采用的设备及生产过程的适应性：（4）菌种的稳定性：（5）产物的得率和产物的浓度：（6）产物容易回收：能满足（3）（6），则有希望成为效益较高的生产菌种。,二、采样时要注意的问题,气候、水分、空气,来源,结合产品的特点,标签：地点、时间、气候等

22、,富集的三种方案：,定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。,三、目的微生物富集的一些基本方法,富集的目的：,让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，,不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法,分解纤维素的细菌的分离分解醛肟的细菌的分离,四、菌落的选出,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基,利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素,从形态的角度,菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,实例：碱性纤维素酶产

23、生菌的筛选（国家七五攻关项目）,采样（造纸厂）,80度30分钟处理,文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌,0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养34天，选择有凹陷圈的菌落,从285个土样中获得62株,26株为组成型,36株为诱导型,例：醛肟水解酶的筛选,-Journal of biotechnology 94(2002),65-72,培养基中含0.05%of Z-PAOx,每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基,不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落,第二节 生物活性物质的筛选,降血脂活性的化合物的筛选抗动脉粥样硬化药物,

24、血浆中的胆固醇来源有外源性和内源性两种途径。外源性胆固醇主要来自食物，可通过调节食物结构来控制摄入量；内源性的则在肝脏中合成。在肝细胞的细胞质中，由乙酸经26步生物合成步骤合成内源性胆固醇。,1.降血脂药（Lipid-lowering drugs）,（1）影响胆固醇合成:HMG-CoA还原酶抑制剂 洛伐他汀（lovastatin）、辛伐他汀(sinvatatin)（2）影响胆固醇吸收和转化:胆汁酸结合树脂 考来烯胺(colestyramine)（3）影响脂蛋白合成、转运及分解：苯氧酸类:氯贝特(clofibrate),吉非贝齐(gemfibrozil)烟酸类：烟酸(nicotinic acid

25、),HMG-CoA 还原酶抑制药：,3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMGCoA）还原酶抑制药，又称为他汀类药（statins），从霉菌培养液中提取，用于临床的有洛伐他汀（lovastatin）、普伐他汀（pravastatin）、辛伐他汀（simvastatin）以及人工合成的氟伐他汀（fluvastatin）、阿伐他汀（atorvastatin）等,HMG-CoA 还原酶是合成胆固醇的限速酶，他汀类结构与HMG-CoA相似，对酶的亲和力比HMG-CoA 高10,000 倍，因此能在肝脏竞争抑制HMG-CoA 还原酶

26、，从而阻碍内源性胆固醇的合成，降低血浆总胆固醇水平。,洛伐他汀（lovastatin）【不良反应】胃肠道反应、头痛或皮疹。转氨酶升高用药后1 6个月检测肝功能。骨骼肌溶解症:肌痛、肌球蛋白尿、肾功能衰竭，在合用免疫抑制剂环孢素或降血脂药烟酸、吉非贝齐时较易发生。孕妇及哺乳妇女禁用。,降血脂药物,胆酸整合剂 HMGCoA还原酶抑制剂 烟酸及其衍生物 贝特类Fibrates 普罗布考Probucol泛硫乙胺(Pantethine)弹性酶(Elastase)Omega3脂肪酸。,Molecular drug design,创制新药的四要素 生物靶标的选择 检测模型的确定 先导化合物的发现 先导化合物

27、的优化,Molecular drug design,药物分子设计由多学科相互穿插，交替进行,药物设计学,分子生物学结构生物学,基因组生物信息学,数学统计学,药物化学有机药物化学,计算机科学计算化学,分子药理学一般药理学,Introduction,新药研发 R&D of New Drugs新药新药研发过程新药研发涉及学科新药研发特点药物分子设计 Molecular Drug Design概念及内容先导化合物 Lead Compound,先导化合物 Lead compound,简称先导物（Lead），是指新发现的对某种靶标和模型呈现明确药理活性的化合物。应与 hit 相区别,Lead compou

28、nds,A lead is a representative of a compound series with sufficient potential(as measured by potency,selectivity,pharmacokinetics,physicochemical properties,novelty,and absence of toxicity)to progress to a full drug development program.,药物分子设计的策略基础,分子的多样性、互补性和相似性构成了设计方法的策略基础分子的多样性（diversity）是先导物发现的物

29、质基础分子的互补性（complementarity）是分子识别和受体-配体结合的基础和推动力分子的相似性（similarity）在不同的层次上有不同的含义,先导物发现,先导物优化,互补性,相似性,多样性,包容性,反相似性,不相似性,Lead discovery,分子的多样性天然生物活性物质组合化学组合生物合成和组合生物催化基于临床副作用观察产生先导物虚拟筛选分子的互补性基于生物大分子结构和作用机理的药物分子设计反义寡核苷酸,Lead discovery and optimization,分子的相似性基于内源性配体分子的药物设计过渡态类似物肽模拟物生物电子等排置换类似物变换药物合成的中间体基于代

30、谢转化,天然生物活性物质作为先导物,天然生物活性物质来源广泛 植物 动物 微生物 海洋生物 矿物,天然生物活性物质作为先导物,天然生物活性物质的特点 新颖的结构类型（分子多样性）独特的药理活性 资源有限及地域性差异 有效成分含量很低 大多数结构复杂，作用强度不同,天然生物活性物质作为先导物,青蒿素,青蒿素Artemisinin,黄花蒿Artemisia annula,蒿甲醚Artemether,生物利用度较低复发率高,天然生物活性物质作为先导物,喜树碱,羟基喜树碱Hydroxycamptothecin,喜树Camptotheca acuminata,拓扑替康Topotecan,水溶性较差，毒性

31、大,天然生物活性物质作为先导物,紫杉醇,紫杉醇Taxol,红豆杉Taxus,紫杉特尔Taxotere,紫杉特尔,与紫杉醇相比，紫杉特尔的水溶性较大，毒性较小，但疗效相当。已由法国RhonePoulencRore公司生产，美国FDA于1996年批准上市，以多乙氧基醚（polysorbate-80）助溶制成针剂，用于治疗乳腺癌，特别是当化疗失败后可再用它治疗。紫杉特尔在敏感细胞中抑制微血管解聚的作用为paclitaxel 的2倍，在动物和人癌细胞株中的杀伤作用为paclitaxel的1.312倍，并且对paclitaxel耐药的细胞的活性比paclitaxel强数倍。自1990年在欧洲开始临床研究

32、以来，已在欧美，日本和我国完成期临床实验。初步观察对乳腺癌、卵巢癌、肺癌均有效，是一受到广泛重视的新药,天然生物活性物质作为先导物,局麻药,可卡因Cocaine,南美洲古柯Erythroxylum coca Lam,普鲁卡因Procaine,天然生物活性物质作为先导物,抗生素类,天然抗生素,微生物培养液,半合成抗生素,天然生物活性物质作为先导物,他汀类降脂药,美伐他汀Mevastatin洛伐他汀 Lovastatin辛伐他汀Simvastatin普伐他汀Pravastatin,桔青霉菌等Penicillium citrinum,氟伐他汀Fluvastatin,氟伐他汀,完全经化学合成的3羟基3

33、甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂类降血脂新药，与普伐他汀类似，其无需代谢转化而直接具有药理活性。本品氟苯吲哚部分仿拟辅酶，能与HMGCoA还原酶相互作用，竞争性抑制这一催化HMGCoA转化为甲羟戊酸的胆固醇生物合成限速酶，减少细胞内胆固醇贮量，增加低密度脂蛋白的胆固醇(LDLC)受体数量，恢复细胞内胆固醇代谢稳态，并加速从血浆中清除LDLC。本品为右旋(强活性)和左旋(弱活性)组成的消旋体，前者活性强30倍。,天然生物活性物质作为先导物,动物毒素蛇毒Bungarotoxin，N2受体拮抗剂肌松药蛇毒Batroxobin，溶血栓酶抗栓药鱼毒Tetrodotoxin，钠通道阻断剂心血管

34、药物蜂毒Apamin，钙通道阻断剂和钾通道开放剂心血管药物,组合化学Combinatorial chemistry,同时制备含众多分子的化合物库以代数级数增加构建块的数目，库容量则以几何级数增加与高通量筛选（high-throughput screening,HTS）技术结合，可极大地加快先导物发现和优化的速度,组合合成Combinatorial synthesis,平行合成和混分合成固相合成和液相合成小分子组合合成计算机辅助设计及虚拟库合成八学期选修课“组合化学与新药研究”,组合生物合成Combinatorial biosynthesis,基本原理,基因变异（混合、匹配、交换、突变等）,基因

35、克隆,多种变异的酶系,多种非天然的天然物质,聚酮合酶催化合成红霉素,组合生物催化Combinatorial biocatalysis,基本原理,变异酶系或微生物酶系,催化小分子化合物转化,多种人工的天然化合物,岩白菜内酯的生物催化组合库,基于临床副作用观察产生的先导物,作用与作用的分离,异丙嗪的镇静作用,Promethazine异丙嗪（抗过敏药）,Chlorpromazine氯丙嗪（安定）,Thiazinamium噻丙胺（支气管扩张）,磺胺家族的发展,单氨氧化酶抑制剂的发现,格鲁米特的芳构酶抑制作用,筛选发现先导物,随机与非随机筛选 Random/nonrandom screening高通量筛

36、选 High-throughput screening(HTS)虚拟筛选 Virtual screening,Virtual screening,用计算机筛选的方法称为虚拟筛选，或称in silico筛选，成为in silico-in vitro-in vivo模式。用一系列“基于知识的滤片”对虚拟库“筛选”，以“浓缩”出能够满足预定标准的化合物。这些滤片包括类药性(drug like)，药代动力学性质，毒性，知识产权问题以及与受体的互补性或与配体的相似性等，是通过数据库搜寻和计算化学实现的。,Virtual screening,宏基因组技术,Definition：Metagenomics i

37、s the genomic analysis of microorgansims by direct extraction and cloning of DNA from an assemblage of microorganisms(Handelsman,2004).,Experimental approaches to Metagenomics,Techniques of Metagenomics are generally used to explore the properties of microorganisms without prior cultivation.Although

38、 still a novel field of research,Metagenomics has already developed different branches,which contain mainly the following focuses:Discovery of new proteins by functional screening techniques(e.g.screening for an enzyme that is able to degrade a particular toxic compound),analysis of microbioal diver

39、sity in a habitat(e.g.by classical rRNA analysis or phylum estimation from sequence properties),and gene discovery by sequence analysis.Discovery of new medical。,An illustrated example for a metagenomic study,1.The first step of all metagenomic studies is the extraction of a sample from some environ

40、mental habitat.An environmental habitat could be,2.The second step:cloning and sequencing,The environmental samples are further on processed in a molecular biology laboratory.Some of the intermediate steps on the way to obtaining a sequenced metagenome are these:,DNA isolation,Shearing,Tranformation

41、,Cloning,Multiplication:the host organism multiplies(and obtains)the transformed material.,Sequencing,Construction and screening of metagenomic libraries.Schematic representation of construction of libraries from environmental samples.The images at the top from left to right show bacterial mats at Y

42、ellowstone,soil from a boreal forest in Alaska,cabbage white butterfly larvae,and a tube worm,?,第三节 菌种保藏,第二节 菌种的衰退、复壮与保藏 一、微生物菌种衰退的原因 1.原因 一是菌种保藏不妥;二是菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件；三是经诱变获得的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征的情况。连续传代是菌种退化的直接原因，这是由于菌种经常处于旺盛的生长状态。衰退菌株的特点：个体或群体特征发生变化；生产能力降低；代谢能力降低；发酵周期延长；抗不良环境能力降低。

43、,（一）菌种的衰退,返回本节,2 防止菌种衰退的措施,菌种的分离:因为在菌种发生衰退的同时，并不是所有的菌体都衰退，其中未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的，具有更强的生产能力。因此，对于已衰退的菌株采用单细胞菌株分离的措施，即用稀释平板法或用平板划线法，以取得单细胞所长成的菌落（colony），再通过菌落和菌体的特征分析和性能测定，就可获得具有原来形状的菌株，甚至性能更好的菌株（strain）。,如果菌种已经发生退化，产量下降，则要进 行分离复壮。,如对芽孢杆菌(Bacillus)，可先将菌液用沸水处理几分钟，再用平板进行分离，从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体。如果遇到某些菌株即使进行单细胞

44、分离，仍不能达到复壮的效果，则可改变培养条件，达到复壮的目的。如AT3.942栖土曲霉(Aspergillus terricola)的产孢子能力下降，可适当提高培养温度，恢复其能力。同时通过实验选择一种有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。,其它防 衰 措 施菌种的复壮提供良好的环境条件使用优良的保存方法定期纯化菌种,二、菌种的复壮,通过分离达到复壮:菌落纯/细胞纯 在琼脂平板划线、涂布或与琼脂培养基混合培养再分离，达到菌落纯 采用单细胞或单孢子分离法达到细胞纯通过寄主体达到复壮:对于寄生性微生物的退化菌株,将菌株接种到寄主细胞进行繁殖达到复壮。,三、菌种保藏（strain preserv

45、ation）,基本原理：根据菌种的生理、生化特点，人为地创造条件，使菌种的代谢活动处于休眠状态。要求：维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来优良的生产性能。保藏时首先选择优良纯菌种，最好是它们的休眠体如孢子（spore）、芽孢(gemma)等；其次是要创造一个有利于休眠的环境条件，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，使菌体的代谢活动处于最低状态，延长其保存期。,（一）菌种保藏 1、目的：提高菌种存活率，减少菌种的变 异，保持原来优良的生产性能。2、原理：根据菌种的生物生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖处于休眠状态。保藏时首先要挑选优良纯种，最好

46、是它们的休眠体（孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。,返回本节,（一）保藏目的及原理,目的,返回本节,保存方法：应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同时也要考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保存方法，以便长期保藏。酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封保藏法。霉菌：斜面保藏法和沙土管保藏法。细菌和放线菌：一般细菌以采用冷冻干燥保藏法为佳。放线菌可用沙土或冷冻保藏法保藏。短期可采用斜面保藏。保藏应注意的问题：菌体状态：休眠体 基质：营养贫乏 操作过程：不应对细胞造成伤害,3

47、、菌种保藏的方法：斜面保藏法、矿物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷冻干燥法、冷冻法、液态真空干燥法、琼脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麦粒保藏法、无水硅胶保藏法。（1）斜面保藏法：在4左右的冰箱保藏，每隔一定时间进行移植培养后再继续保藏，如此反复。优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长，传代多，菌种容易变异。适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌,（二）常用保藏法,以母种形式保藏,1.斜面低温法斜面菌种置46冰箱中（36个月）,返回本节,返回本节,（2）矿物油保藏法 将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层高于斜面末端1cm，然后

48、放于冰箱中保存。适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种,2.矿油保藏法,无菌检验？,返回本节,返回本节,（3）砂土管保藏法 利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两步。适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以及酵母不适用。,（4）真空冷冻干燥法 先在菌悬液加入保护剂（如：脱脂牛奶、血清等）然后在较低温度下使成冻结状态，最后减压抽干。特点：它是菌种保藏中最有效的一种方法。保存期可达一年至数十年之久，并且存活率高，变异率低。单使手续麻烦，需要一定的设备。适用菌种：对于不长孢子或长的很少孢子的真菌保藏效果不佳。,（5）其他保

49、藏方法冷冻法：分低温冷冻（20）与超低温冷冻（196）两种。适用于细菌、真菌、病毒等的保藏液态真空干燥法：菌体在恒温液态条件下进行真空干燥。适用于包括细菌、病毒，特别适用于冷冻干燥保藏效果不佳的菌种。琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产孢子细菌的保藏,曲法保藏：将麸皮与水按比例混合，灭菌后接入菌种，待孢子长成后即为成曲。将试管放入盛有氯化钙的干燥器中，干燥后低温保藏。适用于有大量孢子的霉菌和某些放线菌的保藏。麦粒保藏法：麦粒灭菌后接入菌液，培养有菌丝或孢子时，置通风、避光、干燥处保藏。适用于一些放线菌、芽孢杆菌、酵母的保藏。无水硅胶保藏法：将细胞悬浮液和等体积的脱脂灭菌牛奶混匀，加入装有无水硅胶的试

50、管中，然后将试管放于干燥器内，室温或4 保藏。对于细菌和真菌效果都较好。,9、基因工程菌的保藏,由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。,国内外菌种保藏机构,菌种是一个国家的重要资源，世界各国对菌种的保藏都极为重视。世界上有700多家菌菌种保藏机构，其中国际知