《生化制药》PPT课件.ppt

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1、1 调整期：细菌代谢活跃，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP以及其他细胞成分 2 对数期：细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定（调整期和对数期的细菌几乎不存在种内斗争）3 稳定期：有害代谢产物积累，新增细胞数目与死亡 细胞数目达到动态平衡，次级代谢产物大量积累，形成芽孢（稳定期的细菌种内斗争最激烈）4 衰亡期：细菌数目急剧下降，出现畸形细菌（衰亡期的细菌和无机环境的斗争最激烈）,基因组文库的构建步骤,1、从组织或细胞提取基因组DNA；2、用限制性酶部分水解成适当长度的DNA片段，经分级分离选出一定大小合适克隆的DNA片段；3、通常采用噬菌体或柯斯质粒载体等容载量较大的克隆载体，在适当位点

2、将载体切开；4、将基因组DNA片段与载体进行体外连接；5、重组体DNA直接转化细菌或用体外包装的重组噬菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组DNA的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。,cDNA文库的构建步骤,从生物体或细胞中提取mRNA；利用逆转录酶以寡聚核苷酸为引物合成cDNA的一条链；利用DNA聚合酶I，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链；cDNA与载体的体外连接；噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。,动物细胞培养基种类和组成,动物血清的作用,提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素；提供有利于细胞贴壁所需的贴壁因子和生长因子；提供可识别金属、激素、维生

3、素和脂质的结合蛋白；提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素；提供良好的pH缓冲系统。,葡萄糖氧化酶催化葡萄糖与氧反应生成葡萄糖酸和H2O2，生成的H2O2在过氧化物酶的作用下分解为水和原子氧，新生态的原子氧将无色的还原型邻联苯甲胺氧化成蓝色物质。颜色的深浅与样品中葡萄糖浓度成正比。随着样品中葡萄糖浓度的增加，酶试纸的颜色由粉红一紫红一紫色一蓝色，不断加深。其反应过程如下：,此酶试纸已在临床中用以测定血液或尿液中的葡萄糖含量，以诊断糖尿病。,酶偶联法检测葡萄糖原理,利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物

4、，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。,发酵工程制药的定义,1、微生物菌体的发酵,SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）生物防治制剂（如苏云金杆菌）活性乳制剂,细胞的生长与产物的积累成平行关系，生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段。,微生物发酵类型,2、微生物酶发酵,各种酶制剂：糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等天冬酰胺酶：抗癌纳豆激酶、链激酶：治疗血栓青霉素酰化酶：青霉素生产,需要诱导或遭受阻遏、抑制等调控作用，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需注意。,3、微生物代谢产物发酵,初级代谢产物：与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的氨基酸、核苷酸

5、、维生素、糖类等菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累,次级代谢产物：与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等结构较复杂，对环境条件敏感,4、微生物转化发酵,利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链等。,反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、结构位置特异性、立体特异性。,如：甾体转化,可的松（Cortisone）,药用发酵产品分类,生物来源,作用对象,作用机制,化学结构,细菌真菌放线菌,抗菌药抗肿瘤药抗病毒药除草剂酶抑制剂免疫调节剂,抑制细胞壁合成药影响细胞膜功能药干扰蛋白质合成

6、药抑制核酸合成药抑制生物能量反应药,抗生素维生素氨基酸核苷酸甾体激素酶及酶抑制剂,发展趋势,利用DNA重组技术和细胞工程技术的发展、新的工程菌和新型微生物的开发；新型的生理活性多肽和蛋白质类药物：干扰素、白介素、促红细胞生成素等；新型菌体制剂和疫苗。,红细胞生成素(治疗贫血)生长激素(促进生长)胰岛素(治疗糖尿病)干扰素(抗病毒、抗肿瘤),发酵菌种的选育要求,生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它类似代谢产物少。操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离。稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳定、不易变异退化。安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素。,从

7、自然界中获得新菌种,土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端环境等基本程序：采样预处理富集培养筛选鉴定野生型菌株诱变育种物理或化学方法诱发突变。物理诱变剂：紫外线、X-射线、-射线等化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等,杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交换。原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现遗传物质的交换。基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，技术含量高，应用面广。菌种保藏(Culture conservation)目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。,菌种保藏三要素,典型菌种的优良纯种的休眠体；创造有

8、利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）；尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。,菌种保藏的常用方法,斜面低温保藏法石蜡油封存法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法,1、分批培养的定义,分批培养是一种间歇式的培养方法，在每一批次的培养过程中，不再加入其它营养物料。待生物反应进行到一定程度之后，将全部培养液倒出、进行后道工序处理。,为了提高生物反应器在分批培养中的效率通常采用多级分批培养的办法。即在小型生物反应器中接入少量种子经过分批培养，来获得较大数量的细胞作为种子再转入到大型生物反应器中,分批培养的设备要求较少操作也较简单工业微生物生

9、产中经常采用,3、分批培养中影响细胞生长的因素,共有以下5种影响因素：（1）营养物质浓度（2）温度（3）pH值（4）溶解氧浓度（5）产物（1）营养物质浓度 营养物质的限制性浓度-当某一种营养物质的浓度下降到一定程度之后，就会影响细菌的生长，此时的浓度就称为营养物质的限制性浓度。营养物质的最大浓度-当某一种营养物质的浓度超过一定程度之后，也会对细菌的生长产生抑制作用。,（2）温度,当培养温度偏低时，细胞的生长速率较低，随着温度的升高，细菌的生长速率也随之加快，当温度超出一定范围时，由于蛋白质等细胞结构的变性，导致细菌生长速率的急速下降。,微生物细胞的最适生长温度并不等于其代谢产物的最佳生产温度。

10、因此在具体的生产过程中，培养的前期常常将温度调控在有利于细胞生长的区域，而在后期则常常将温度转到最佳的生产温度，以获得较多的产物,根据培养温度的要求的不同，可以将微生物分成：低温菌，中温菌，高温菌。采用高温菌生产有许多优点：（1）高温菌所生产出的酶，其热稳定性较好。（2）高温菌的培养温度较高，细胞的生长速率较大。（3）不容易发生杂菌污染。（4）在大规模生产时可以节约冷却水、同时能够减少动力消耗。,发酵温度调控技术,（3）pH值,细菌适宜于在中性、弱碱性的条件下生长。酵母菌、霉菌则喜酸性环境。乳酸菌、醋酸菌对于低PH值环境有着很好的耐受性。（4）溶解氧浓度不同的培养过程对于溶解氧有着不同的要求应

11、该根据具体情况来加以控制。,（5）代谢产物的抑制作用,细胞的代谢产物会影响到细胞的生长，这种现象称作产物抑制作用。而代谢产物多数就是生物制物的原材料。因此，在实际生产过程中要设法定期收集细胞的代谢产物,1、连续培养方法的优点（1）细胞生长速率较高。（2）连续培养可发使得培养液达到一个稳定状态,2、连续培养方法的缺点（1）连续培养延续的时间长，发生杂菌污染的概率也就增加（2）长时期进行连续培养，细胞发生变异、质粒丢失、基因突变、（3）细菌株生产性能退化的现象也就比较突出,（1）单级连续培养,新鲜培养基的加入速率=培养之后的物料抽出速率。这种培养方法称为单级连续培养法。在单级连续培养方法之中，发酵

12、液体积保持恒定，生物反应器中各组分分布均匀。单级连续培养是一种最简单的连续培养方法。,（2）细胞回流式的单级连续培养,将单级连续培养流出液中的细胞加以浓缩，然后再送回到生物反应器中，这种方法称为细胞回流式的单级连续培养。细胞回流式的单级连续培养相当于不断地对生物反应器进行接种，有利于提高连续培养的效率。,（3）多级连续培养,将几个生物反应器串联起来，第一个反应器的流出液作为第二个反应器的流入液，第二个反应器的流出液又作为第三个反应器的流入液，这种培养方式就称为多级连续培养法。,1、补料分批培养,补料分批培养法是介于分批培养和连续培养之间的一种操作方法。是指在进行分批培养中间，向生物反应器中加入

13、营养物质进行补料，但同时不取出培养液的方法。,由于补料，使得培养液的体积逐渐扩大，到一定时间之后，再将培养液从反应器中一次性放出。,（1）方法改良,连续补料分批培养法在进行补料分批培养时，如果所取出的培养液数量少于补进的物料数量，反复进行多次的放料和补料操作，这种方法称为连续补料分批培养。,（2）补料分批培养的优点,（1）通过流加高浓度的营养物质，培养罐内的细胞浓度可以达到非常高的程度这对于细胞产物的生产十分有利,（3）通过补料，能够解除某些营养物的低浓度限制效应提高产物的合成效率。,（2）通过补料和放料的连续进行，能够解除某些基质、产物对细胞的抑制作用,发酵设备发酵罐,发酵罐的特点轴封严密，泄漏少能承受一定压力、温度搅拌通风装置保证气液充分混合具有足够的冷却面积死角少，灭菌彻底适宜的径高比（高与直径的比值为2.54）,培养基的灭菌空罐灭菌实罐灭菌连续灭菌发酵过程中的中间分析项目产物产量pH糖氨基氮菌丝形态,