《猪病诊断技术》PPT课件.ppt

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1、一、猪病综合诊断,（一）现场快速诊断1、临诊流行病学调查；2、临诊症状观察；3、尸体剖检。（二）实验室诊断1、病理组织学诊断；2、病原（因）学诊断；3、血清学诊断。,1、猪病流行病学调查的步骤和内容,（1）调查步骤及方式根据检测材料的不同，动物流行病学调查分为临诊流行病学调查、血清学流行病学调查和病原学流行病学调查。现就临诊流行病学调查的方式、内容进行讨论。方式多样化,如充分利用公司销售网络、现代通讯手段或以座谈方式向畜主或相关知情人员询问疫情，或到现场进行仔细调研，取得第一手资料，然后进行综合归纳、分析处理，作出初步诊断。,（2）调查内容 疾病流行情况：最初发病时间、地点，随后蔓延的情况，目

2、前的疫情分布。疫区内猪的饲养数量和分布情况，发病猪的数量、年龄、性别、品种，疫病传播速度和持续时间等。本次发病后是否进行过诊断，采取过哪些措施，效果如何。防疫情况如何，接种过哪些疫苗，疫苗来源、免疫方法和剂量、接种次数等。是否做过免疫监测，群体抗体水平如何。发病前有无饲养管理、饲料、用药、气候等变化或其他应激因素存在。查明感染率、发病率、病死率和死亡率。,特别关注以下指标的调查,感染率：受检猪中阳性猪数/受检猪数100%发病率：某一段时期内某一特定风险猪群发生某病比率。调查时期常为一年；特定猪群可指某个地区、某个猪场、某个猪群、甚至某个猪场内的某个日龄段的猪等。而风险猪群专指未患过该病因而缺乏

3、特异抵抗力而有患该病风险的猪群。发病率直接测定发病风险，是分析病因的重要依据。,患病率：特定时间所调查猪群中某病新旧病例数，而不管这些病例的发病时间,反映了某病的致病力。病死率：是指在一定的时间内，患某病的病猪中因该病而死亡的比值。病死率反映了某种疾病的死亡概率，表示疾病的严重程度，也反映治疗水平。多用于急性病，较少用于慢性病。死亡率：是某猪群在一定时间内因某病死亡猪数与该猪群同期平均数之比。反映猪群总的死亡水平，是衡量猪群因病死亡危险（机会）大小的指标。也反映一个地区不同时期猪群的健康状况、卫生保健水平。,疫情来源情况：本地过去曾否发生过类似的疫病，在何时何地发生，流行情况如何，是否经过确诊

4、，有无历史资料可查，何时采取过何种防治措施，效果如何；如本地未发生过，附近地区曾否发生过；这次发病前，周边地区有无疫情；曾否由其他地方引进过活猪、猪产品或饲料，输出地有无类似的疫病存在；是否有外来人员进入本场或本地区进行参观、访问或购销等活动。,传播途径和方式情况：本地各类有关猪的饲养管理制度和方法；活猪尤其是病猪流动、收购以及防疫卫生情况；交通检疫、市场检疫和屠宰检验的情况；病死猪处理睛况；有哪些助长疫病传播蔓延的因素和控制疫病的经验；疫区的地理、地形、河流、交通、气候、植被和野生动物、节肢动物等的分布和活动情况，它们与疫病的发生及蔓延传播之间有无关系等。其他：该地区的政治、经济基本情况，群

5、众生产和生活活动的基本情况和特点，畜牧兽医机构和工作的基本情况，当地领导、兽医、饲养员和群众对疫情的看法如何等。,2、临诊症状观察,就是用望、闻、问、切、叩、嗅等最基本的症状观察方法，通过我们的眼、耳、手、鼻和脑等发现症状，经过分析，做出症状诊断。主要包括：（1）病猪登记：登记畜主、地址、通讯、猪的有关信息；（2）全面系统检查：外观病症、体温(37.539)、眼结膜、精神、叫声、运动、呼吸、消化、泌尿等系统检查。,3、尸体剖检（后期专门讲解）,尸体剖检是诊断猪流行性疾病（传染病、部分非传染性疾病和寄生虫病）最客观、最直接、最简便、最快速的临床诊断方法。我国猪流行性疾病的致病因素非常复杂，多为混

6、合感染、继发感染、多因素疾病，单从病原学或血清学的方法诊断疾病，很难做出确切诊断，不易分清主次病因，难免出现主观武断或片面错误的结论。从尸体剖检入手结合病原学、血清学及病理组织学诊断才能得出科学的诊断结论。,4、病理组织学诊断,病理组织学诊断：就是取病变组织，通过切片或涂片、染色处理，在光学显微镜下观察细胞组织病变，对疾病做出诊断。包括细胞形态学、组织化学方法。组织样品采集及送检：（1）一般包括肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、心脏、淋巴结、脑等。（2）采样部位：应采集病变与正常组织交界处的组织，以便于诊断观察。（3）采样大小：采集的组织样品不宜过大，一般采集1.51.5cm大小的组织块，置于10%福尔

7、马林溶液中，同一动物的组织应保存于一个容器中。（4）样品的保存及运送：样品经固定后可长期保存，送至实验室做病理组织学检查。,5、病原（因）学诊断,对致病原因做微生物分离培养、鉴定或利用现代分子生物学方法，查找致病病毒、病原菌、寄生虫等，属病原学诊断。（1）传统方法：病毒：接种细胞分离病毒；电镜观察病毒粒子；光镜观察包涵体或进行免疫组化检测病原相关抗原；动物接种试验等。细菌：直接染色观察；分离鉴定；动物接种试验等.寄生虫：直接观察或经处理光镜观察。霉菌毒素：色谱仪、紫光仪、免疫学方法等检测毒素含量。,（2）现代分子生物学（基因诊断）方法基因诊断是采用分子生物学方法在DNA水平或RNA水平对某一基

8、因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。基因诊断可以利用特定的DNA探针与目的基因形成分子杂交的机理，也可以利用已知DNA序列设计引物对目的基因进行PCR扩增，从DNA水平和mRNA的基因转录水平上检测出正在生长的病原体或潜伏病原体，确定现行感染还是以往感染；省却有些病原体原来需体外培养后方可诊断的步骤。从而对传染性疾病作出诊断。,感染性疾病外源性基因的检测：主要包括感染性病毒、细菌、支原体、寄生虫等在猪体内存在的生物外源性DNA或RNA。这类检测一般根据已知的外源DNA序列采用PCR或RT-PCR的方法就可以进行快速、简便而准确的诊断；因而，传染性疾病的基因诊断应用性极强，目前已经在临床上普遍

9、开展。,聚合酶链式反应（PCR）技术。通过检测特定基因进而检测病原体，PCR现已成为基因诊断的主要方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点；而反转录PCR(RT-PCR)则用于检测RNA病原体。,分子探针技术：DNA探针杂交技术是以已知DNA片段作为探针与待测样品DNA或其片段进行核酸分子杂交，从而确定两者的同源程度。另外，根据重组技术所制造的基因芯片，即将特定序列DNA片段（基因探针）固定在硅片上，用于基因测序，寻找病原的目的基因或对基因的序列进行分子水平上的分析。,主要猪病病原检验取样样品参考表,6.血清学诊断,（1）凝集试验 凝集试验的原理是：颗粒抗原(红细胞、细菌、病毒等)与

10、含有相应抗体的血清混合,在电解质的参与下,则能发生特异性结合，形成抗原抗体复合物,这种复合物呈均匀状态悬浮于液体中,这时肉眼是看不见的,当抗原抗体复合物在一定浓度的电解质作用下,复合物表面的电荷大部分被消除,失去了互相排斥的作用，复合物之间互相吸引，凝集成团,即出现肉眼可见的凝集现象。作用于凝集反应的抗原,称为凝集原,与之相结合的抗体,称为凝集素。,全血平板凝集试验:本试验在实践中主要用于细菌性疾病的抗体检测和抗原(经分离培养后)的鉴定。如猪丹毒抗原(丹毒杆菌的纯培养液)测定被检猪血清中的抗体。试管凝集试验:试管凝集试验是一种定量法,用于测定被检血清或其他体液中有否某种抗体及其效价,可作临床的

11、辅助诊断,或用于流行病学监测。在猪场中,本法常用于猪布氏杆菌病的诊断。,间接红细胞凝集试验：本法简称间接血凝试验。其原理是：将抗原(或抗体)吸附在比其体积大千万倍的红细胞表面,只需少量的抗体(或抗原)就可使这种致敏的红细胞通过抗原和抗体的结合而出现肉眼清晰可见的凝集现象。这种试验能大大提高反应的敏感性,如猪瘟检测.用抗体致敏红细胞检测相应的抗原,称为反向间接血凝试验,反之,称为正向间接血凝试验。在猪病的诊断中,常采用本法对猪口蹄疫、水疱病、猪瘟、传染性胸膜肺炎等疾病抗原的鉴定,或抗体的检测。,乳胶凝集试验：本法在猪病中主要用于伪狂犬病和萎缩性鼻炎的诊断,是用其病毒致敏乳胶抗原来检测被检猪的血清

12、、全血或乳汁中的抗体,具有简便、快速、特异、敏感的优点。,（2）沉淀试验 沉淀试验的原理是：利用可溶性抗原如细菌的培养滤液、病毒的可溶性抗原和血清等,与相应的抗体结合,在电解质存在时,可形成肉眼可见的白色沉淀物。参加沉淀反应的抗原,称为沉淀原，抗体叫做沉淀素。沉淀试验的具体方法有多种,如环状沉淀试验、琼脂扩散试验和免疫电泳等。在猪病的诊断中,目前最常用的是琼脂扩散试验。本法可用已知抗原测定未知抗体,反之亦然。在猪病的实验室诊断中，常用于猪伪狂犬病的抗体检测,也可用此法检查猪瘟、猪水疱病和猪痘等疾病。,（3）酶联免疫吸附试验(ELISA)免疫酶技术是根据抗原与抗体特异性结合的功能,以酶作标记物,

13、利用酶对底物具有高效催化作用的原理而设计的,它既可用于抗原的诊断,也可进行血清抗体的检测。本试验是通过化学方法将酶与抗体(或抗原)结合起来,标记后的抗体(或抗原)仍然保持与相应抗原(或抗体)相结合的免疫学活性。例如,酶抗体与相应抗原结合后,形成酶标抗体-抗原复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时,催化底物分解、氧化而生成有色物质,有色产物的出现,客观地反映了酶的存在。,根据有色产物的有无及其浓度,即可间接推断被检抗原或抗体是否存在及其数量,达到定性和定量的目的。目前对于猪瘟、伪狂犬病、繁殖与呼吸综合征、流行性腹泻、旋毛虫病、猪气喘病等疾病,均采用免疫酶技术进行病原诊断，抗体检测和血清学流行病学

14、调查,并且已成为规模化猪场化验室工作的一项重要内容。,二、诊断检测样品的采集、处理和运送,（一）采样原则 1.适时采样：样品是有时间要求的，应严格按规定时间采样；有临床症状需要作病原分离的，样品必须在病初的发热期或症状典型时采样，病死的动物，应立即采样。2.合理采样：根据诊断检测要求，须严格按照规定采集各种足够数量的样品外，不同疫病的需检样品各异，应按可能的疫病侧重采样。对未能确定为何种疫病的，应全面采样.,3.典型采样：选取未经药物治疗、症状最典型或病变最明显的样品，如有并发症，还应兼顾采样。4.无菌采样：供病原学及血清学检验的样品，必须无菌操作采样，采样用具、容器均须灭菌处理，尸体剖检需采

15、集样品的，先采样后检查，以免人为污染样品。5.适量采样：采集样品的数量要满足诊断检测的需要，并留有余地，以备必要的复检使用。,6 样品处理:采集的样品应一种样品一个容器，立即密封，根据样品的形状及检验要求不同，做暂时的冷藏、冷冻或其他处理。供病毒学检验的样品，数小时内要送到实验室，可只作冷藏处理。超过数小时的应冻结处理。（冻结方法：可将样品放入-30度冰箱内冻结，然后再装入小冰块或干冰冷藏瓶（箱）内运送）。供细菌学检验或血清学检验的样品，冷藏送实验室即可。,装样品的容器应贴上标签，标签要防止因冻结而脱落，标签标明采集时间、地点、号码和样品名称并附上发病、死亡等相关资料，尽快送实验室。7 安全采

16、样:采样过程中，需做好采样人员的安全防护，并防止病原污染，尤其必须防止外来疫病的扩散，避免事故发生。,（二）血清 1.采血方法及采血量：从耳静脉（或前腔静脉）采血5毫升，室温放置约10分钟（以血液完全凝固为准），再置冰箱冷藏（4度）30分钟，此时，能清楚看到血清与血凝块分离，然后分离血清，保存于1.5-2毫升塑料离心管中，冷冻保存待检。2.编号要求：所有送检样品统一用阿拉伯数字1、2、3、-编号（养殖场请保存好原猪号与送检编号对照表）。,3.样品说明：所有送检样品要求附带采样场场名、免疫情况（免疫程序、免疫疫苗种类、生产厂、免疫剂量等）、采样对象等详细说明材料。4.运输：每个养殖场的样品必须单

17、独密封于两层自封口塑料袋中，粘贴单位名称标签，外包一层脱脂棉后，连同采样单一并放入稍大一些的自封口塑料袋，置于冰盒或装有冰袋的泡沫箱中迅速运至检测室。如不能及时送检，应将血清冻存于冰箱中。,（三）血液,1 病毒检验样品：应在动物发病初体温升高期间采集。血液样品必须是脱纤血或是抗凝血。抗凝剂可选肝素或EDTA，枸橼酸钠对病毒有轻微毒性，一般不宜采用。采血前，在真空采血管或其他容器内按每10ml血液加入0.1%肝素 1ml或EDTA20ml,从前腔静脉真空采血或用注射器抽取，用量少时也可以从耳静脉抽取。采集的血液立即与抗凝剂充分混合，防止凝固；采脱纤血液时，先在容器内加入适量小玻璃珠，加入血液后，

18、反复振荡，以便脱去血液纤维。采集的血液经密封后贴上标签，以冷藏状态立即送实验室。必要时，可在血液中按每毫升加入青霉素和链霉素各500-1000IU，以抑制血源性或采血中污染的细菌。,2 细菌检验样品：采血应在动物发病初体温升高或发病期，并未经药物治疗期间采集，血液应脱纤获加肝素抗凝剂（或EDTA或枸橼酸钠），但不可加入抗生素。血液密封后贴上标签，冷藏尽快送实验室，否则须置于4度冰箱内做暂时保存，但时间不宜过久，以免溶血。3 寄生虫及附红细胞体病检验样品：因不同的血液寄生虫在血液中出现的时机及部位各不相同，因此，需要根据各种血液寄生虫的特点，取相应时机及部位的血液制成血涂片，送实验室。,（四）组

19、织,组织样品一般由扑杀动物或扑杀垂死的动物和病死尸体剖检中采集，也可以从活动物体内采集。从尸体采样时，先剥去动物胸腹部皮肤，以无菌器械将腹腔、胸腔打开，根据检验目的和生前疫病的初步诊断，无菌采集不同的组织。从活动物体采取组织样品，一般需使用特殊的器械。,1 病毒检验样品：做病毒检验的组织，必须以无菌技术采集，组织应分别放入无菌的容器内并立即密封，贴上标签，放入冷藏容器立即送实验室。如果途中时间较长，可作冻结状态运送，也可以将组织块浸泡在pH7.4左右的乳汉液或磷酸缓冲肉汤保护液内，并按每毫升保护液加入青霉素、链霉素1000IU，然后放入冷藏瓶内送实验室。,2 细菌检验样品：供作细菌检验的样品，

20、应新鲜并以无菌技术采集，如遇尸体已经腐败，某些疫病的致病菌仍可采集与长骨或肋骨，从骨髓中分离细菌。采集的所有组织应分别放入灭菌的容器内或灭菌的塑料袋内，贴上标签，立即冷藏送实验室。必要时也可以做暂时冻结送实验室，但冻结时间不宜过长。,（五）分泌液和渗出液,1 分泌液和渗出液包括眼分泌液、鼻腔分泌液、口腔分泌液、咽食道分泌液、乳汁、尿液、脓汁、阴道（包括子宫和宫颈）渗出液、皮下水肿渗出液、胸腔渗出液、腹腔渗出液、关节囊（腔）渗出液等。采集这些分泌液或渗出液时，必须无菌操作。,2 眼、口腔、鼻腔、阴道的分泌液或渗出液，以灭菌的拭子蘸取；脓汁的采集，做病原菌检验的应在药物治疗前采取，采集已破口的脓灶脓汁，宜用棉拭子蘸取；未破口的脓灶脓汁，用注射器抽取；咽食道分泌物，可用食道探子从已扩张的口腔伸入咽、食道处反复刮取；尿液样品可在动物排尿时收集，也可以用导管导尿或膀胱穿刺采集；皮下水肿液和关节囊（腔）渗出液，用注射器从积液处抽取;,胸腔渗出液的采集，用注射器从肋间刺入抽取；乳汁的采集，先将乳房、乳头作清洗消毒后，用手挤取乳汁，除挤出的乳汁弃去，收集后挤的乳汁。3 所采集的各种分泌物或渗出物，立即分别加入已灭菌的玻璃瓶内密封，贴上标签，冷藏，迅速送实验室。,