《液相色谱基础》PPT课件.ppt

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1、液相色谱基础知识,第一节 色谱法概述第二节 液相色谱法第三节 液相色谱图相关术语第四节 HPLC的主要类型及原理,第一节 色谱法概述,一、色谱法简介二、色谱法的定义和分类三、气相色谱和液相色谱的区别四、色谱法的分离原理,关于色谱,色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器常见的分离方式：蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤等等,色谱是其中一种分离工具,一、色谱法简介,色谱法（Chromatography）溯源俄国科学家Tswett 1903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献1906年正式命名（见诸文献）色谱法；Chromatography50年代开始广泛

2、研究和应用主要是气相色谱及薄层色谱高效液相色谱法的广泛应用始于70年代,色谱的发明人,俄国科学家：M.S.Tswett正式命名“色谱”的文献,色谱起源,经典液相色谱,二、色谱法的定义和分类,色谱法的定义：色谱法又称色层法或层析法，是一种利用不同溶质(样品)与固定相和流动相之间的作用力(分配、吸附、离子交换等)的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次“平衡”，使各溶质达到相互分离的方法。,固定相：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。,色谱法的分类 根据流动相的状态将色谱法分成四大类。,1.按两相分子的聚集状态分类

3、,2.按固定相的固定方式分类,平面色谱,3.按分离机制分类,流动相 固定相 类型液体 固体 液-固色谱液体 液体 液-液色谱气体 固体 气-固色谱气体 液体 气-液色谱,液相色谱,气相色谱,三、液相色谱与气相色谱的比较,液相色谱所用基本概念与所用基本理论均与气相色谱一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别。,（1）应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为

4、困难；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析。,（2）液相色谱能完成难度较高的分离工作 气相色谱的流动相载气是惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。,液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱是不可能的。液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。,四、色谱法的分离原理,1液固色谱法分离原理：使用固体吸附剂，根据固定相对样品组

5、分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。吸附剂：为硅胶或氧化铝，粒度5-10m。适用对象：适用于分离分子量200-1000的组分，大多数用于非离子型化合物，常用于分离同分异构体。,2液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于基质表面，或化学键合于基质表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。,液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四

6、氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物。,反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。,正相色谱法与反相色谱法比较表,第二节 液相色谱法,一、液相色谱的分类二、高效液相色谱的特点三、高效液相色谱法的仪器配置四、高效液相色谱的基本流程五、高效液相色谱的应用,液相色谱的分类,根据固定相的使用形式将液相色谱分成以下几类：1.柱色谱：固定相装在玻璃管或金属管内，或涂在柱内壁上。又分为填充柱色谱和空心毛细管色谱两种类型。2.纸色谱：

7、用滤纸做载体，吸附在滤纸上的水为固定相，试样溶液在纸上进行展开、分离。3.薄层色谱：将固定相均匀地涂铺在玻璃板或塑料板上，样品的展开、分离在玻璃板或塑料板上进行。,4.高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography高效液相色谱法，简称：HPLC是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段。广泛应用于各个领域：医药/环保/石化/生命科学/食品及农业在技术，理论及应用上仍处于发展阶段,HPLC的特点,高压压力可达150-300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。高速流速为0.1-10.0 ml/min。高效可达5000塔板每

8、米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度紫外检测器灵敏度可达0.01ng，同时消耗样品少。,HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：,速度快通常分析一个样品在15-30 min。分辨率高可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。柱子可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。,HPLC的仪器配置,色谱泵,自动进样器,色谱柱及柱温箱,检测器,数据处理系统,溶剂,一、高压输液系统 高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。,1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮

9、存足够数量、符合要求的流动相。,2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。,泵应具备的性能：1.流量稳定；2.流量范围宽：分析型应在0.1-10mL/min范围内连续可调，制备型应能达到100mL/min；3.输出压力高：一般应能达到150-300kg/cm2；4.液缸容积小:便于清洗和更换流动相；5.耐腐蚀,密封性好。,高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。

10、恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。,泵的使用和维护注意事项,防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。,流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。,泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气

11、泡，泵就无法正常工作。,3.梯度洗脱装置 等度洗脱：在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适用于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱：就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。,梯度洗脱装置分为两类：一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。,二、进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，

12、它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。,三、分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱是色谱系统的心脏，对色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快等。,柱的构造 色谱柱由柱管、压帽、密封圈、筛板、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。色谱柱两端的柱接头有筛板，是烧结不锈钢或钛合金。,色谱柱的尺寸规格1.常规分析柱：内径2-5mm,柱长10-30cm;2.窄径柱：内径1-2mm,柱长10-20cm;3.毛细管柱：内径0.2-0.5mm;4.半制备柱：内径5mm;5.实验室制备柱：内径20-40mm,柱长10-30cm

13、；6.生产制备柱：内径达几十厘米。,柱的使用和维护1.避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动；2.应逐渐改变溶剂的组成；3.一般来说色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质；4.选择适宜的流动相,以避免固定相被破坏；5.避免将基质复杂的样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或在进样器和色谱柱间连接保护柱。,四、检测器 检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、

14、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。,1.紫外吸收检测器（UV）是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器。因为大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外吸收性质，所以该检测器是液相色谱中应用最广泛的检测器，几乎所有液相色谱仪都配置了这种检测器。,2.二极管阵列检测器（diode-array detector,DAD）以光电二极管阵列作为检测元件的UV-VIS检测器，它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三

15、维谱图。,DAD是HPLC检测技术的重大进展。采用这种检测器可以瞬间实时对流出液进行全光谱检测,使HPLC能提供的信息量大幅度增加。换句话说,在一次色谱操作中,可同时获得吸光值、流出时间和各组分的紫外-可见光谱图在一起的三维谱图,提供既定量又定性的色谱信号。,样品池,二极管阵列,光栅,D2/W 灯,每一组分可在每一波长处得到一吸光度值,多波长检测三维色谱图,紫外检测器和DAD检测器的区别：普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流通池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流通池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。,3.示差折光检测器

16、是目前液相色谱中常用的一种检测器，它可连续检测参比池流动相和样品池中流出物之间的折光指数差值，这一差值和样品的浓度成比例关系。某些不能用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等，可用示差折光检测器检测。,4.荧光检测器 荧光检测器是一种高灵敏的,选择性检测器,其灵敏度比UV高10-1000倍,一般可测ppb级的化合物。它用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将无荧光的物质衍生成荧光体。可用荧光检测的物质：如某些代谢物、食品、药物、氨基酸、多肽、胺类、维生素、石油高沸点馏分、生物碱和甾族化合物等。,糖精钠：学名是邻磺酰苯酰亚胺钠，甜度是蔗糖的200-250倍。除了在味觉上引起甜

17、的感觉外，不参与人体代谢，对人体无任何营养价值。虽至今尚未发现由其引起的中毒事件，但各国都严格控制其适用范围和使用量。,5.蒸发光散射检测器 可以检测挥发性低于流动相的任何样品，是广泛用于高效液相色谱中的通用检测器。优势：样品结构不需要具备紫外发色团和合适的折射率；对梯度洗脱和流动相系统的温度变化不敏感；在一次分析中可以同时检测主要成分和杂质。,表2.液相色谱常用检测器的一般性质,液相色谱的基本流程,开机 最后开检测器配制流动相流动相平衡进样数据处理关机 先关检测器，后冲洗,高效液相色谱仪基本装置,流动相,进样阀,注入样品液,色谱柱,检测器,色谱处理机,高压泵,流出液,液相色谱的基本流程图,流

18、动相,泵,色谱柱,检测器,泵输液,分离,检测,记录,进样阀,进样,1.流动相的配制,流动相应具有的特点流动相脱气流动相过滤去除微粒流动相贮存,流动相具备以下的特点：1.流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中。2.流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应。3.流动相的黏度要尽量小，以便降低柱压，延长液体泵的使用寿命。,HPLC常用流动相的黏度（mPas）乙醇：1.08 甲醇：0.54 乙腈：0.34 异丙醇：2.3,4.流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外线吸收较低的溶剂配制。5.流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。,2

19、.流动相的脱气处理,脱气处理的原因1.防止洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。2.溶解的氧气会导致样品中某些组分被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。,3.常用的脱气方法比较,氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最好。在线真空脱气法：HPLC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显

20、优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。,4.流动相为什么要滤除微粒,溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。,5.选择合适的滤膜,聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推荐用于蛋白质和其相关的样品。再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。注意：1）每张滤膜只能用一次。

21、2）水相和有机相不要搞混。,6.流动相的贮存,流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。如需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。,7.柱温控制,柱温箱的作用1.保留时间精确再现；2.提高分辨率；3.对高分子化合物或黏度大的样品，分析时柱温必须高于室温；4.对一些具有生物活性的生物分子，要求低的柱温。,第三节 高效液相色谱基本概念,色谱图：HPLC

22、图形结果（Chromatogram）,色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。,色谱峰,保留时间（分）,基线,峰高,峰宽,响应值,液相色谱图相关术语,色谱峰 Peak色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线峰底 Peak Base峰的起点与终点之间连接的直线峰高 Peak Height峰最大值到峰底的距离峰宽 Peak Width在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半（高）峰宽 Peak Width at Half Height通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离,液相色谱图相关术语,峰

23、面积 Peak Area峰与峰底之间的面积,又称响应值鬼峰 Ghost Peak并非由试样所产生的峰；亦称假峰基线 Baseline在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线基线漂移 Baseline Drift基线随时间定向的缓慢变化基线噪声,N Baseline Noise由各种因素所引起的基线波动,液相色谱图相关术语,洗脱（elution）:流动相流过固定相的过程，又叫淋洗。保留时间，tR Retention time组分从进样到出现峰最大值所需的时间保留体积，VR Retention volume组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积死时间(dead time，t0)不保留组

24、分的保留时间。死体积(dead volume，V0)由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。,分配系数 在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。可由Langmuir（朗缪尔）方程得出：Kd-分配系数 q、c-溶质在固相和液相中的浓度,理论塔板数的计算方法,N-理论塔板数 tR-保留时间W1/2-半峰宽 Wb-峰底宽度,理论塔板高度：,L-柱长,Rs分辨率：分辨峰的能力，两峰相对其峰宽而言，分开有多远。分辨率高低取决于选择性和柱效.选择性和柱效是可以互补的。,对称性：指峰的形状。,第四节 HPLC的主要类型及原理,凝胶层析色谱 离子交换色谱 亲和层析

25、色谱 疏水层析色谱 反相色谱,凝胶层析色谱,又称为体积排阻色谱（size exclusion chromatography,SEC）是一种纯粹按照溶质分子在流动相溶剂中的体积大小分离的色谱法。填料上具有一定尺寸的孔隙，大分子进不去而先流出色谱柱，小分子后流出。在用水系统作为流动相的情况下，又称为凝胶过滤色谱（GFC）。,优点：1.与其他色谱相比，操作简便，介质价廉易得；适合于大规模生产；2.溶质和介质不发生任何形式的相互作用，故操作条件温和，回收率接近100%；3.分离结束后，无须对分离介质进行清洗和再生，故容易实施循环操作；4.作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤相比，剪切力小

26、，蛋白质的回收率高。5.分离机理简单，操作参数少，易于放大。,缺点1.分离仅限于分子量的差别，选择性低，处理量少；2.经GFC洗脱后，样品被稀释，因此需浓缩单元操作。,一、凝胶介质对介质的要求：1.亲水性高；2.表面惰性，不发生化学和物理变化；3.高稳定性，有较宽的pH适应范围；4.具有一定的孔径分布；5.机械强度高，耐高压操作，寿命长。,介质的类型：,凝胶介质特征参数排阻极限(exclusion limit)：指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的M。如，Sephadex G50的排阻极限为30kD。分级范围(fractionation range)：能阻滞组分并且使组分相互之间得到分离的组分

27、分子量范围。如，Sephadex G50的分级在1.5-30KD内。,床体积(bed volume)：1g干燥gel溶胀后所占有的体积。如，Sephadex G50的床体积为9-11 cm3/g干胶。空隙体积(void volume)：凝胶之间的空隙体积，即V0。,二、凝胶的处理,凝胶使用前要首先要进行处理：1）估计用量 选择好凝胶的类型后，首先要根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。干胶用量(g)柱床体积(mL)/凝胶的床体积(mL/g)由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加1020(质量分数)。,2)水中溶胀 不同类型的凝胶所需的溶胀时间不同。一般吸水

28、率较小的凝胶其溶胀时间较短，在20条件下需34 h；但吸水率较大的凝胶其溶胀时间则较长。如果加热煮沸，则溶胀时间会大大缩短，一般在15 h即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。,3）排除凝胶中气泡 膨胀处理后，要对凝胶进行纯化和排除气泡处理。纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。排除凝胶中的气泡是很重要的，否则会影响分离效果，可以通过真空抽气或加热煮沸的方法排除气泡。,4）凝胶的保存 凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的20%乙醇溶液，4下保存。如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥，装瓶保存。,三、凝胶层析色谱的基本操作,1层析柱的选

29、择 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。层析柱的长度对分辨率影响较大，一般来讲，长的层析柱分辨率要比短的高。一般柱长度不超过100 cm。,凝胶过滤层析过程示意图,2000年中科院考研题2003年上海师范大学考研题,指出从分子排阻层析柱上洗脱下来下列蛋白质时的洗脱顺序，为什么？分离蛋白质的范围是5,000-400,000。肌红蛋白（马心肌）16900 过氧化氢酶（马肝）247500 细胞色素c（牛心肌）13370 肌球蛋白（鳕鱼肌）524800 糜蛋白酶原（牛胰）23240 血清清蛋白（人）68500,2.装柱（凝胶层析柱）,1）除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一

30、致，装柱过程中温度也要恒定。2）应调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。3）将柱子固定在稳定的支架上，并保证其垂直。4）先向柱内加满洗脱剂，检查层析柱是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要除去床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15。,5）将胶浆徐徐注入层析柱内。注意避免产生气泡。凝胶柱床一般应离柱顶3-5cm，并覆盖一层溶液。6）柱装好后，使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶柱，以压实凝胶，这个过程称为平衡。,7）检查柱装得是否均匀和V0的测定 用一个被该凝胶完全排阻的有色大分子物质作样品进行层析，则既检查了装

31、柱质量也测定了V0。层析时，若有色区带移动不整齐，说明柱装得不好。此大分子的洗脱体积(Ve)就是该凝胶柱的空体积(V0)。蓝色葡聚糖(blue dextran)2000是平均分子质量为2106Da并与蓝色染料偶联的一种葡聚糖，通常用它来测 V0。,3洗脱液的选择 由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用，其流动相只起运载工具的作用，所以和其他层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。一般来说，只要能溶解样品并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。,4.加样量 加样量对实验结果可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。加样量的多少要根据具

32、体的实验要求而定：凝胶柱较大，加样量就可以较大；样品中各组分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的15(质量分数)左右。,5.洗脱速度 洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。,主要应用,（1）脱盐：高分子溶质（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐

33、过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25。,（2）用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。,（3）测定分子量：把一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一种成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据该物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。,分别称取1mg冷冻干燥的标准蛋白样品，溶于1mL pH 7.0（0.02mol/L）磷酸盐缓冲液中，10000r/min转速

34、下离心10min，除去不溶物。取上清液20L用Superdex peptide PE7.5/300进行柱层析，流速0.25mL/min，检测波长为214nm。用大分子蓝色葡聚糖2000和细胞色素C的洗脱体积测定凝胶柱的外水体积V0，以其余四种标准蛋白的洗脱体积Ve为纵坐标，LogMr为横坐标绘制出一条标准蛋白洗脱曲线。,离子交换色谱（IEC）,离子交换色谱是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。优点：高选择性；高载量；浓缩性；高的回收率。,阳离子交换层析过程,离子交换树脂,蛋白质,高离子强度洗脱液洗,高离子强度

35、洗脱液洗,加样,平衡液洗,收集,1998年上海交大考研题,有一蛋白水解物，在pH6时，用阳离子交换柱层析，第一个被洗脱出来的氨基酸是：Val(pI=5.96),Lys(pI=9.74)Asp(pI=2.77),Arg(pI=10.76)Tyr(pI=5.66),二、离子交换树脂的分类,按物理结构分类：凝胶型（孔径为5nm);大孔型（孔径为20100nm);按合成的树脂所用原料单体分类：苯乙烯系、酚醛系、丙烯酸系、环氧系、乙烯吡啶系。,最常用的分类是依据树脂离子交换功能团分。主要可分为：（1）强酸性阳离子交换树脂（2）弱酸性阳离子交换树脂（3）强碱性阴离子交换树脂（4）弱碱性阴离子交换树脂,几种

36、离子交换树脂,1、树脂的选择（以DEAE-纤维素为例）,三、离子交换色谱的基本操作,阳离子阳离子交换树脂阴离子阴离子交换树脂,2.膨胀活化,目的是除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。称取所需的量，加入0.5mol/LNaOH溶液中，浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤，以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液接近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5mol/L HCl中1h,同样抽滤至滤液至中性，在浸于0.5mol/LNaOH溶液中，同样处理，洗至中性。最终转为-OH-型或盐型交换剂。,3.装柱,装柱：树脂洗至中性后借助水的重力使树脂自然沉积，避免夹杂气泡现象。,4.平衡,平衡至所需的pH和离子强度;用0.0

37、1 mol/L pH 7.4 PBS 溶液流经色谱柱，至流出液体的pH值与加入的PBS液的pH值相近时为止。,5.上样,一般为交换剂交换总量的1-5。,1.等度洗脱,6.洗 脱,缺点：洗脱体积大,溶质洗脱不尽。,2.线性梯度洗脱(linear gradient elution)线性梯度洗脱的优缺点优点：流动相连续变化，不易出现干扰峰，操作范围广；缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器。,3.阶梯洗脱法(stepwise elution),优点：无须特殊设备，操作简单；缺点：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象。,7、树脂的再生,例：玉米肽的分离纯化氨基酸的平均等

38、电点在6.0左右，而 Alcalase酶的水解液的pH为8.5，使得玉米肽在溶液中带负电荷，所以，确定采用强阴离子交换层析分离纯化Alcalase水解玉米蛋白粉的水解液。本实验采用Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析进行多肽的初步分离。柱型：1.6*20cm，床高11cm，上样量：10mL；样品浓度：11.84mg/mL。,疏水相互作用层析（HIC）,是一种液相吸附层析，依据生物分子之间的疏水性的差别进行分离。疏水配基一般是低密度分布在填料表面上。流动相一般为pH6-8的盐水溶液（NH4）2SO4，作降浓梯度淋洗，在高盐浓度条件下，蛋白质疏水基团暴露出来，与固定相疏水缔合

39、；浓度降低时，疏水作用减弱，逐步被洗脱下来。,吸附剂1.基质：同一般的层析介质，如交联琼脂糖、硅胶、树脂等。2.配体：如苯基、烷基（C3-C8）、烷氨基、聚乙二醇等。基质与配体以共价键偶联在一起。,Octyl Sepharose Fast flow疏水性中等，适合各种蛋白的分离与纯化Butyl Sepharose Fast flow疏水性最弱，适合含脂族配体生物分子的分离与纯化Phenyl Sepharose Fast flow疏水性最强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子的分离与纯化。,疏水层析的基本操作,1.介质的选择 若待分离物质分子量很大，且样品量较大，应选大孔基质，如琼脂糖凝胶；若待

40、分离物质较小，或样品量很小，但分辨率的要求高，则可选孔径小的基质甚至非孔型基质。,2.样品的准备往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐浓度达到与流动相A中基本一致，并调节样品溶液的pH使其满足吸附条件。HIC的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加样。,3.层析条件不同盐类对疏水作用的强度有影响，层析中的选择性也不尽相同；盐浓度也随目标分子的疏水性而异。硫酸铵常用0.75-2mol/L,氯化钠为1-4mol/L流动相B为不含盐的缓冲液，缓冲液与流动相A一致。,4.洗脱方式采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱。通过往流动相中添加有机溶剂，如：丙醇、异丙醇等

41、，降低流动相极性。,再生或贮存再生溶剂采用双蒸水或氢氧化钠溶液洗脱贮存用20%乙醇溶液,特点：1.互补工具：HIC主要用于蛋白质类分离纯化，虽然HIC不如IEC的应用广泛，但可以作为IEC的互补工具。如方法得当，HIC与IEC的分离效率相当。2.与盐析衔接：由于在高浓度盐溶液中疏水性较大，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液。3.可以通过调节疏水性配基链长和密度来控制吸附性能的大小，因此可根据目标产物的性质选择适当的吸附剂。4.疏水性吸附的种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。,亲和层析（AF）,在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与

42、配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。,当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。,原 理,亲和层析过程,含配体溶液,收集目的蛋白,洗下未结合的蛋白,混合蛋白样品,平衡液,带有配体的树脂珠（或胶粒）,特点,优点：上样量大，分辨率高，操作步骤

43、少，被分离物质的活性不易丧失。缺点：每分离一种物质都必须找到合适的配体，并将其制备成固相载体。,可选择的配体有1.抑制剂2.效应物3.酶的辅助因子4.类似底物5.抗体,反相色谱,反相色谱是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式。任何一种有机分子的结构中都有非极性的疏水部分，这部分越大，一般保留值越高。在高效液相色谱中这是应用面最广的一种分离模式。,反相色谱与疏水层析的区别：1.反相色谱介质上疏水配基的取代程度大大高于HIC介质，反相色谱更适合在水-有机溶剂体系中具有良好稳定性的肽和小分子蛋白质的分离纯化；2.HIC过程洗脱条件温和，通常降低洗脱剂的盐浓度就能达到目

44、的，在蛋白质的纯化中有较广泛的应用。,固定相：以C18硅烷化制备的试剂最多，统称为ODS 柱（Octadecyl silica）。流动相：极性有机溶剂的水溶液(甲醇，乙晴，异丙醇、正丙醇和四氢呋喃等)。洗脱：有机溶剂增加。,Influence of Particle Size on the Separation effect,HPLC的应用,在食品研究中的分析应用食品中的天然成分碳水化合物类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇脂肪酸和有机酸蛋白、肽、氨基酸食品添加剂酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂抗氧化剂、防腐剂颜料和染料（色素维生素污染物霉菌（黄曲霉毒素农药和兽药残留多环芳烃（PAHS和亚硝酸,HPLC

45、 的应用,在生物化学和生物工程中的应用氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)在精细化工分析中的应用醇、醛和酮、醚的分离分析酸和酯的分离分析表面活性剂的分析聚合物的分析研究药物、农药、染料、炸药等工业产品在无机离子分析中应用饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析,HPLC的应用,在公安、刑警破案工作需要毒品分析等在环境污染分析中的应用废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺类的检测*2004年获悉，世界上化合物总数达到4700万，其中绝大部分是有机化合物，而大约有70以上是不挥发的。对HPLC来说，只要被分析物质在流动相溶剂

46、（各种各样中有一定的溶解度便可分析。所以，HPLC在各行各业有着广泛的应用潜力。,三聚氰胺,奶粉中的假蛋白，婴儿的杀手,那么，到底三聚氰胺是什么东西呢？,三聚氰胺粉末,三聚氰胺（英文名Melamine），是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，是重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺，又叫2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪。分子结构 分子式 C3N6H6 分子量 126.12,三聚氰胺的分子结构图,物理化学特性,三聚氰胺性状为纯白色单斜棱晶体，无味，密度1.573gcm3(16)。快速加热升华，升华温度300。溶于热水，微溶于冷水，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。

47、低毒。,主要用途,三聚氰胺是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂（MF）的原料。该树脂硬度比脲醛树脂高，不易燃，耐水、耐热、耐老化、耐化学腐蚀、有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。,人体对三聚氰胺耐受标准,三聚氰胺是一种低毒的化工原料。动物实验结果表明，其在动物体内代谢很快且不会存留，主要影响泌尿系统。三聚氰胺量剂和临床疾病之间存在明显的量效关系。三聚氰胺在婴儿体内最大耐受量为每公斤奶粉15毫克，以体重7公斤的婴儿为例，假设每日摄入奶粉150克，其

48、最大耐受量为15毫克/公斤奶粉。,三聚氰胺HPLC-UV检测方法,按照美国食品药品监督管理局(FDA)的三聚氰胺检测方法和中国农业部公布的三聚氰胺检测方法，采用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱分离三聚氰胺，可以得到良好的分离效果：1、仪器与条件(a)仪器：HPLC色谱仪，带有UV检测器；(b)色谱柱：Venusil ASB-C18 4.6250mm;标准：中国农业部颁布标准方法;缓冲液：10mM柠檬酸,10mM庚烷磺酸钠;流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15;流速：1.0mL/min;柱温：40;波长：240nm。,2、试剂与样品 样品、甲醇、氨水、乙酸铅、三氯乙酸、三聚氰胺标准品、柠檬

49、酸、辛烷磺酸钠。甲醇为色谱纯，其他均为化学纯。,3、实验方法(1)标准样品配制：取50mg三聚氰胺标准品，以20%甲醇溶解定容至50mL得到1000ppm的标准溶液，使用时用提取液(0.1%三氯乙酸)稀释至所要的浓度。(2)提取：称取奶粉样品5g，加入50ml 0.1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入2mL2%乙酸铅溶液，超声20min。然后取部分溶液转移至10mL离心管中，8000r/min离心10min，取上清液3mL过混合型阳离子交换小柱(PCX)。,(3)净化(PCX小柱，60mg/3mL)：a)活化及平衡：3mL甲醇，3mL水b)上样：加入提取液3mLc)淋洗：3mL水；3mL甲醇；弃

50、去淋洗液并将小柱抽干。d)洗脱：5mL5%氨化甲醇(v/v)洗脱。(5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇)。e)浓缩：50，氮气吹干，20%甲醇/水定容至2mL，HPLC分析或衍生后GC/MS分析。,（4）HPLC 参考条件色谱柱：C8柱，250 mm4.6 mm，5 m，或相当者C18柱，250 mm4.6 mm，5 m，或相当者。b)流动相：C8柱，离子对试剂缓冲液-乙腈（85+15，体积比），混匀。C18柱，离子对试剂缓冲液-乙腈（90+10，体积比），混匀。,c)流速：1.0 mL/min。d)柱温：40。e)波长：240 nm。f)进样量：20 L。,（5）标准曲线的绘制 用