《流式试剂培训》PPT课件.ppt

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1、流式细胞仪原理及试剂销售培训,贝克曼库尔特公司生物科学部 朱晓春,流式细胞仪的基本原理,流式细胞术的基本概念,流式细胞术（Flow Cytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,流式细胞术的特点,极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。可同时分析

2、单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析 强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选,流式细胞仪的检测范围,细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体,散射光信号,Right An

3、gle Light Detector Cell ComplexitySSC,Forward Light Detector Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,前向角散射光（FSC,Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC,Side Scatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性,Laser,FALS Sensor,FSC信号,SSC信号,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,Side Scatter,流式细胞仪的检测的荧光信号,荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗

4、原的表达含量,FITC,PE-Cy5,PE,荧光信号,双色直接染色,CD3-FITC,CD19-PE,数据分析,数据显示:直方图(Histogram)二维点图(Dot Plot)等高线图(Contour Plot)密度图(Density)三维图（3D Plot）等,数据分析,单参数直方图分析,凋亡细胞峰,数据分析,双参数点图分析,荧光素及染料介绍,五光十色的荧光素,单分子荧光素耦合的复合荧光素分子新型的荧光素样荧光物质Qdots,常用激光和荧光素搭配,BlueFITCPEPerCPPerCP-Cy5.5PE-Texas Red(ECD)PE-Cy5PE-Cy7PIEGFP,RedAPCAPC-

5、Cy7UVDAPIHoechst,常用的标记单克隆抗体的荧光素,488nm激光激发：FITC（异硫氰酸荧光素）：荧光强度可受pH的影响，当pH降低时其荧光强度也随之减弱PE（藻红蛋白）PerCP（多甲藻叶绿素蛋白）：光量子产量并不太高，最好应用在检测表达较高的抗原上PerCP-Cy5.5（叶绿素蛋白偶联物）PE-Cy7（藻红蛋白偶联物）PE-Cy5（藻红蛋白偶联物，又称Cy-Chrome）PE-Texas Red（藻红蛋白-德州红偶联物，又称ECD）633nm激光激发：APC（别藻青蛋白）APC-Cy7（别藻青蛋白偶联物）,荧光及荧光发生机理简介,荧光及荧光素：某些物质在特定波长范围内的光线照

6、射下，可发出波长比照射光波长长的光线 即荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素.荧光发生机理：室温下荧光素分子大部分处于“基态”，当荧光素在一定波长（激发波长）的光的照射下吸收光能后（经染色后的细胞在激光束的照射下），荧光染料吸收能量能级跃迁，进入新的状态，称为“激发态”，处于激发态的分子不稳定，它可以通过在10-910-7秒的极短时间内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。,荧光素的激发和发射光谱,任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（nm）激发光谱（Excitation，Ex）：是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围

7、内的光线，也称为吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max发射光谱（Emission）：是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光发射波峰（最大发射波长）：Em-Max荧光素的使用：选择正确的激光器确定所需荧光探测器（PMT）,区别,光学系统：滤光片,置于荧光探测器前，利用二向色性长通滤片(DL)及带通滤片(BP)可将不同荧光染料发出的相应波长光谱区别开,二向色性长通滤片(DICHROIC FILTER)，一定波长以上的光通过，该波长以下的光被反射。45度角放置。,550nm 的光通过550nm 的光被反射,带通滤片(BAND PASS)，允许一定波长的光通过。,550nm

8、DL,620nm BP（620/20）,可以允许610630nm的光通过,Fluorescence Spectrum Viewer,FITC,Fluorescence Spectrum Viewer,PE,Fluorescence Spectrum Viewer,PE-Cy5,Fluorescence Spectrum Viewer,PE-Cy7,Fluorescence Spectrum Viewer,PerCP,Fluorescence Spectrum Viewer,APC,Fluorescence Spectrum Viewer,PI,Fluorescence Spectrum Vie

9、wer,EGFP,Fluorescence Spectrum Viewer,DAPI,Fluorescence Spectrum Viewer,FITC和EGFP能否一起使用,荧光染料比较(平均荧光强度)Q-Prep/ImmunoPrep 试剂系统,PerCP APC FITC ECD PC5 PE,CD8-FITC,CD8-PE,CD8-ECD,CD8-PC5,CD8-PerCP,CD8-APC,PerCP APC FITC ECD PC7 PC5 PE,Dye Intensity Comparisons,Data generated on EPICS Altra on a single d

10、onor,PC7 Dye Performance,CD8-PC7(FC500 or FACSCalibur),CD8-PC7(XL),XL-单激光四色的荧光光谱示意图,FC500-单激光五色的荧光光谱示意图,常用的核酸荧光标记探针,PI（碘化丙啶）：可嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中，主要用于对DNA染色，使用时需用RNase对细胞进行处理；不能透过活细胞膜对核酸染色，可用于鉴别活死细胞，对活细胞染色时需对细胞膜打孔，以便染料透过。488nm激光激发，发射光谱宽泛550725nm，在贝克曼的流式细胞仪上使用ECD荧光素通道。TO（噻唑橙）：可用于对网织红细胞中的RNA进行检测定量分析

11、，TO的荧光强度与RNA含量由良好的线性关系，对细胞膜的通透性好，可直接对活细胞染色，488nm激发，可发射出530nm荧光，使用FITC荧光素通道。,常用荧光素激发、发射、滤光片波长,Qdots-纳米微晶体：未来的荧光素,同一种光源激发一种晶体发射多种荧光,Qdots 605的激发波长和发射波长（VERY SHARP）,常用荧光染料组合,FITCPE：最常用的双色组合FITCPEPE-Cy5：最常用的三色组合，进行多色荧光染色时荧光光谱重叠补偿很小FITCPEPerCP+APC：BD最常用的四色组合FITCPEECD+PE-Cy5:贝克曼库尔特公司最常用的四色组合FITCPEECD+PE-C

12、y5+PE-Cy7：贝克曼贝克曼库尔特公司最常用的五色组合，而且PE-Cy7与FITC、PE、PE-Cy5标记的抗体一同使用时的荧光补偿小PE-Cy5可与FITC、PE同时使用，但不能与APC同时使用，二者之间荧光干扰太大,BD/BC公司常用的荧光染料,488nm激光激发的荧光染料 FITC(BD)FITC(BC)PE(BD)PE(BC)PerCP(BD)PE-Cy5(PC5)(BC)PE-Cy7(PC7)(BD)PE-Cy7(PC7)(BC)ECD(BC)633nm激光激发的荧光染料 APC(BD)APC(BC)APC-Cy7(BD),BD/BC公司不同仪器能使用的荧光染料,BD Calib

13、ur(488nm+633nm双激光)FITC/PE/PerCP(或者PE-Cy5，或者PE-Cy7)/APC BD Canto II(488nm激光/633nm激光/407nm激光)FITC/PE/PerCP/PE-Cy7/APC/APC-Cy7/Pacific BlueBC XL(488nm激光)FITC/PE/ECD/PE-Cy5 FITC/PE/PE-Cy5/PE-Cy7BC FC500(488nm单激光)FITC/PE/ECD/PE-Cy5/PE-Cy7 BC FC500(488nm+633nm双激光)FITC/PE/ECD/APC/PE-Cy7,流式抗体的选择搭配及对照的设定,CD分

14、子,CD（cluster of differentiation）分子目前已不仅仅专指白细胞分化抗原，还有红细胞膜表面抗原，血小板表面抗原，髓系细胞表面抗原及其他组织细胞表面或细胞内的抗原等，是细胞分化成为不同谱系（lineage）、不同阶段以及活化过程中或疾病状态下出现或消失的抗原标记，或上述抗原识别的抗体CD命名方法识别同一抗原2种以上的单克隆抗体作为一个抗体群，每一抗体群以CD后面加上数字来表示，如CD3，CD20等相同CD上存在着不同的抗原决定簇且可被特定的单克隆抗体识别时，在CD数字后面加上小写字母用以区分，如CD1可细分为CD1a、CD1b、CD1c及CD1d；CD49又分成CD49

15、a-f在CD数字后带有大写字母“R”时，指该CD仅发现于某特定类型的细胞上，如CD45是白细胞共同抗原，而CD45R是仅发现于单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞及部分T淋巴细胞的膜抗原非CD类抗原常结合CD分子进行检测，有助于一些疾病的发病机制研究及诊断、治疗等,CD抗原及其相关细胞群,细胞群 CD抗原 T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 B细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94 血小板 CD3

16、1 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f 内皮细胞 CD105 CD106 CD109 细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126,抗体(Antibody),抗体的种类及选择的原则,单克隆抗体混合单克隆抗体多克隆抗体,荧光直标的抗体未标记的抗体（需要荧光标记的二抗进行间接标记检测）,单分子荧光素复合分子荧光素,选择可靠公司的高质量的产品，事半功倍,由一株B细胞杂交瘤增生而成的单一克隆细胞所产生的一种高度均一,

17、高度专一性的抗体.(Monoclonal Antibody,McAb).1975年,Koehlerz 和Milstein首次应用细胞融合技术将小鼠免疫脾(B)细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞.这种杂交瘤细胞既保持了骨髓瘤细胞大量无限增生的特性,又继承了免疫B细胞合成分泌某种特异性抗体的能力.应用该技术,即可得到均一化学结构和单一特异性的抗体分子,成为单克隆抗体,简称单抗.每种单抗只识别某一特定的抗原决定簇,具有高度特异性.目前生产的单抗以动物源性为主.单抗种类:纯净品荧光抗体(将单抗与不同荧光染料结合)生物素化抗体(单抗与生物素结合),单克隆抗体,Mouse anti-Human CD

18、3-FITC Clone:UCHT1 Isotype:IgG1 MouseMouse:抗体来源-小鼠Anti-Human:检测对象为人类细胞CD3-FITC:检测CD3的抗原,该抗体为FITC荧光素标记UCHT1:抗体的Clone 株IgG1 Mouse:为抗体的免疫球蛋白亚型,所以选用的阴 性对照应为Mouse IgG1-FITC,如何读懂荧光标记的单克隆抗体,所有的检测要建立对照试验来去除非特异性结合（背景）,荧光染色对照的设置,阳性对照使用已知阳性样本，帮助排除试剂的质量、浓度、特异性以及染色方法等因素阴性对照空白对照（自发荧光）自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。

19、自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高，自发荧光越强。实验样本（自发荧光特异荧光非特异荧光）特异荧光，即抗体F(ab)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光同型对照（自发荧光非特异荧光）,同型对照的选择,同型对照（Isotype Control）：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型与染色的单克隆抗体 相同种属来源 相同免疫球蛋白及亚型 相同荧光素标记 相同剂量和浓度用于消除由

20、于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应选用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1(1)-FITC和IgG2a(2a)-PE,荧光染色对照的设置,补偿对照（双色或多色分析时）荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色 几色分析就需要制备几个补偿对照管,双色荧光补偿1,双色荧光补偿2,

21、各种对照的设立,荧光抗体组合的选择和搭配1,用不同颜色的荧光素标记不同种类的单克隆抗体，可以在一个细胞上同时分析多种抗原分子，但并非各种荧光抗体均可以自由地组合在一起，在确定组合选择之前，还必须考虑到一些影响因素1.流式细胞仪的类型及荧光光谱选择适当强度的光源作为荧光物质的激发光源，并选择适合于被检荧光物质选择性吸收的光谱滤光片接收荧光2.了解不同抗体的细胞反应谱，以及染色模式根据不同的实验目的选择抗体。因为相同CD编号的抗体可能识别不同的抗原决定簇。如CD45RA表达在幼稚/静止T淋巴细胞，而CD45RO表达在记忆/活化T淋巴细胞。胞膜和胞内染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞内染色，最

22、后是DNA染色。,荧光抗体组合的选择和搭配 2,3.抗体结合荧光素的荧光强度 每一种荧光素的相对荧光强度都不一样。一个特定抗体，能否区分阴性与阳性结果，即有较好的S/N比值，取决于该抗体用何种荧光素标记。荧光素相对强度也与仪器有关，这是由于不同仪器使用的激光和滤光片组合不同，因此造成了荧光强度的差别。4.抗原密度 高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原（如细胞因子）则需要用较高S/N比值的荧光素（如PE,PE-Cy5,APC）标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细胞群和阴性细胞的目的。,荧光抗体组合的选择和搭配 3,5.荧光光谱之间的重叠在多色分析中，虽然可以通过荧光补偿消除荧光光谱重叠的影响，但使用荧光探针的种类越多，补偿的复杂程度增加，因此选择光谱重叠越少的组合越好6.自发荧光每个细胞群体的自发荧光水平都不同，自发荧光在高波长范围里（600nm）迅速降低。因此检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如PE-Cy5/PE-Cy7），可得到较好的S/N比7.荧光素浓度、配伍不当、试剂的质量均导致假阴性/假阳性结果一个抗体组合内的抗体可能来源不同的公司，有不同的浓度、不同的亚型，可能均需要自身的同型对照，而实际上，这是非常困难的。尽量选择同一家公司的试剂可以减少干扰。,Thanks!,