《沉淀技术》PPT课件.ppt
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1、现代生化分离技术Separation Methods in Biochemistry,2,第三章 沉淀技术,第三章 沉淀技术,3,第三章 沉淀技术,第一节 概述,沉淀是溶液中的溶质有液相变成固相析出的过程,表示一个新的凝结相的形成过程,或由于加入沉淀剂使某些离子成为难溶化合物而沉积的过程。是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。沉淀VS结晶,本质上同一种过程。同类分子或离子以有规则排列形式析出结晶;以无规则的紊乱排列形式析出沉淀。,3.1.1 沉淀的定义,4,第三章 沉淀技术,3.1.2 沉淀的类型:,晶形沉淀:颗粒最大,其直径大约在0.11 m之间。在沉淀内部,离子按晶体
2、结构有规则地进行排列,因而结构紧密,整个沉淀所占的体积较小,极易沉降于容器底部。凝乳状沉淀:颗粒大小介于上述二者之间,其直径大约为0.021 m,因此其性质也介于二者之间。无定型沉淀:颗粒最小,其直径大约在0.02 m以下。沉淀内部离子排列杂乱无章,并且包含有大量水分子,因而结构疏松,体积庞大,难以沉降。,5,第三章 沉淀技术,沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法,目前仍广泛应用在工业上和实验室中。由于其浓缩作用常大于纯化作用,因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法,用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质,然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。沉淀法由于成本低、收率高、浓缩倍
3、数高可达l0-50倍和操作简单等优点,是下游加工过程中应用广泛的值得注意的方法。缺点:针对复杂体系而言,分离度不高、选择性不强,3.1.3 沉淀技术的应用特点,6,第三章 沉淀技术,第二节 沉淀方法的分类,盐析有机溶剂沉淀等电点沉淀非离子多聚物沉淀聚电解质沉淀法高价金属离子沉淀法热沉淀法,7,第三章 沉淀技术,盐析法蛋白质在水溶液中的溶解度受盐浓度影响,1、基本原理,蛋白质表面特性,蛋白质溶解:相似者相溶亲水性和疏水性:有利因素:亲水性,包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水蛋白所占的%等。如白蛋白不利因素:疏水性,包括暴露的疏水基团、疏水蛋白所占的%等。如纤维蛋白原。,8,第三章 沉淀技术,蛋
4、白质和酶均易溶于水,因为该分子的COOH、NH2和OH都是亲水基团,这些基团与极性水分子相互作用形成水化层,包围于蛋白质分子周围形成1nm100nm颗粒的亲水胶体,削弱了蛋白质分子之间的作用力,蛋白质分子表面极性基团越多,水化层越厚,蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大,因而溶解度也越大。,9,第三章 沉淀技术,盐溶,原理:大多数蛋白类酶都溶于水,而且在低浓度的盐存在的条件下,酶的溶解度随盐浓度的升高而增加,这称为盐溶现象。蛋白质分子吸附盐类离子后,带电表层使蛋白质分子彼此排斥(同性相斥);而蛋白质与水分子的相互作用却加强,溶解性增大。,10,第三章 沉淀技术,盐析(破坏水化膜、中和电荷),1
5、、继续增大中性盐离子强度时大量的盐夺取了自由水,将其转变为盐离子的水化水蛋白质胶体外层的水化膜因盐的夺取而遭到破坏蛋白质胶体表面的疏水区域暴露出来,彼此相互聚集,沉淀;,11,第三章 沉淀技术,2、加入高浓度中性盐后,盐离子与生物分子表面的带相反电荷的离子基团结合,中和了生物分子表面的电荷,降低了生物分子与水分子之间的相互作用,此时生物分子很容易相互聚集,在溶液中的溶解度降得很低,从而形成沉淀从溶液中析出。,12,第三章 沉淀技术,小结原理1.高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低,静电排斥作用减弱.2.中性盐比蛋白质具更强的亲水性,因此将与蛋白质争夺水分子.,13,第三章 沉淀技术,2、盐析
6、公式及讨论,蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系:lgS=-ksI S,蛋白质溶解度(g/L)I0.5MK2SO4的离子强度I(0.5 2 12+0.5 22)/2=1.5。1MNaCl的离子强度(1 12+1 12)/2=1 为常数,I=0时的lgSks为盐析常数,与盐性质(离子价数、离子半径等)、蛋白结构有关,ks越大,盐析效果越好(S越小,越易沉淀),14,第三章 沉淀技术,讨论,1、KsI项Ks与溶液的pH、温度无关,仅取决于蛋白质的性质和盐的种类。盐浓度离子强度IS析出。,lgS=-ksI,15,第三章 沉淀技术,2、值的特性及对盐析的影响,表示不外加盐时的理想溶解度S,受到温度、pH的
7、影响;pH的影响:在pI时最小(调节pH可以导致蛋白质净电荷数变化)温度的影响:高离子强度溶液中,温度升高一般使下降(温度升高利于盐的溶解,夺取更多的水分子,使蛋白质溶解性更差),lgS=-ksI,16,第三章 沉淀技术,3、分段盐析,ks分段盐析:固定蛋白质的pH、T(),变动离子强度I达到沉淀的目的。分段盐析:在一定的离子强度下(I),改变溶液的pH、T,达到沉淀的目。Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感,易产生共沉淀现象,因此常用于提取液的前处理(蛋白质粗品的分级沉淀)。盐析法由于溶质溶解度变化缓慢,且变化幅度小,因此分辨率更高,常用于初步的纯化。,lgS=-ksI,17,第三章
8、 沉淀技术,3、盐析操作要点,3.1 无机盐的挑选原则,高溶解度,能配置高离子强度的盐溶液;溶解度受温度的影响小;盐溶液的密度不高,便于蛋白质沉淀和离心分离;不易引起蛋白质的变性;价格低廉;,18,第三章 沉淀技术,通常采用中性盐,最常用(NH4)2SO4,优点:1、溶解度大:尤其是在低温时仍有相当高的溶解度,这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定,因而盐析操作也要求在低温下(04)进行。硫铵在0时的溶解度70.6g/100mL,Na2SO4-4.9,NaH2PO4-1.6,3.2 盐的选择,19,第三章 沉淀技术,2、不易引起变性,有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋
9、白质用23mol/L浓度的(NH4)2SO4保存可达数年之久。3、次常用Na2SO4。缺点:在30以下溶解度较低,主要用于热稳定蛋白。,20,第三章 沉淀技术,3.3 盐析的操作与应用,3.3.1 盐析的操作方法,盐的处理,硫酸铵使用时要求纯度较高,生产时为降低成本,一般选用化学纯的硫酸铵,在使用前应进行预处理,可通过化学法将重金属除去(如通入H2S后过滤),再将硫酸铵重结晶备用。,21,第三章 沉淀技术,加盐的方法,固体硫酸铵加入法(需要量大时)。将其研成细粉,在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入,接近计划饱和度时,加盐的速度更要慢一些,尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。加入饱和
10、硫酸铵溶液法(需要量小时)。,22,第三章 沉淀技术,3.3.2 盐析的影响因素,蛋白质的种类 蛋白质的种类不同,Ks值会有所不同;分子量越大,沉淀所需盐的量越少;蛋白质分子不对称性越大,越容易沉淀。,23,第三章 沉淀技术,不同浓度的蛋白质溶液产生沉淀所要求的临界盐浓度不同。高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀,若蛋白质浓度过高,易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质,共沉淀作用小,但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.53.0,相当于25 mg/mL30mg/mL。,蛋白质的浓度,24,第三章 沉淀技术,pH值对盐析的影响,在等电点处溶解度小,pH值常选在该蛋白质的等电点附近。,2
11、5,第三章 沉淀技术,温度的影响,对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子,在高离子强度溶液中,温度升高,它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。一般情况下,可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶,要求在04下操作,以避免活力丧失。,26,第三章 沉淀技术,无机盐种类 阴离子盐析作用顺序柠檬酸盐PO43SO42CH3COOClNO3SCN阳离子盐析作用顺序(一价)NH4+K+Na,(NH4)2SO4,27,第三章 沉淀技术,3.3.3 沉淀的再溶解,12倍沉淀体积的下一步所用缓冲液溶解不溶时可能是变性蛋白质或杂质,离心除去。,28,第三章 沉淀技术,
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