《沉淀分离法》PPT课件.ppt
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1、固相析出分离技术,1.概念:通过加入某种试剂或改变溶液条件,使生化产物以固体形式从溶液中沉淀析出的分离纯化技术。,2.种类,3.沉淀和结晶(晶体)的异同点,相同:在本质上同属一种过程(固相析出),条件缓慢变化时,溶质分子有足够时间排列,有利于结晶形成;条件变化剧烈,强迫快速析出,溶质分子来不及排列就析出,形成无定形沉淀。,区别:,结晶法:高度的选择性(原因:只有同类分子 或离子才能排列成晶体)。沉淀法:浓缩与分离,但所得的沉淀物聚集多 种物质,或含有盐类,或包裹着溶剂。,分离效果,第四章沉淀分离法,沉淀法:利用某种沉淀剂或改变条件,使所需提取的物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀
2、的过程。具有浓缩和分离的双重作用。在蛋白质、酶、多肽、核酸和其他细胞组分的回收和分离中应用的很多。,盐析沉淀法有机溶剂沉淀等电点沉淀法成盐沉淀法高分子聚合物沉淀选择性变性沉淀法,一、盐析沉淀法,盐析法:在高浓度中性盐存在下,欲分离物质在中性盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋白质,目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白质(酶)等生物大分子物质。,(一)基本原理 蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白质表面所暴露出的N、O原子的相互作用,所以易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等
3、参数的影响。,蛋白质在自然环境中通常是可溶的,表面:大部分是亲水基团 内部:大部分是疏水基团,蛋白质呈稳定的分散状态,两性物质,一定pH下表面带有一定的电荷,静电斥力作用使分子间相互排斥,蛋白质周围的水分子有序排列,在表面形成水化膜,这一层能保护蛋白质粒子避免因碰撞而聚沉。,当向蛋白质溶液中加入中性盐时:,低盐-盐溶(低盐情况下,随着中性盐离子强度的增加,蛋白质溶解度增大),高盐-盐析(高盐浓度时,蛋白质溶解度随之减小),盐离子部分中和蛋白质的电性,使分子间排斥作用减弱,中性盐的亲水性比蛋白质大,盐离子在水中发生水化作用从而使蛋白质脱去水化膜,暴露出疏水区域,H+,OH-,中性盐破坏水膜,蛋白
4、质的盐析机制示意图,蛋白质沉淀,蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓度有关,还与离子所带电荷数有关,高价离子影响更显著。通常用离子强度表示对盐析的影响。,碳氧血红蛋白的lgS与(NH4)2SO4离子强度的关系,S0,(离子强度),lgS,盐析,盐溶,蛋白质溶解度,起始蛋白浓度,(二)无机盐的选择,在蛋白质盐析中,常用的盐析剂有(NH4)2SO4,Na2SO4,MgSO4,NaH2PO4,NaCl,Na3PO4,K3PO4。,(NH4)2SO4原因,廉价在水中溶解度大,且溶解度随温度变化小,低温下仍具有较大的溶解度对大多数蛋白质的活力无损害,常用盐析剂在水中的溶解度(g/100ml水),盐析
5、效果:阴离子 阳离子尤其以高价阴离子更为明显。,阳离子对盐析效果的影响:Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+,无机盐可按两种方式加入溶液中:,直接加入固体(NH4)2SO4粉末工业生产(分批加入,充分搅拌)加入(NH4)2SO4饱和溶液实验室和小规模生产(防止溶液局部过浓,但加量较多时溶液会被稀释),(三)影响盐析的各种因素,无机盐的加入量蛋白质的浓度温度pH操作方式,1.无机盐加入量的影响,S0,(离子强度),lgS,盐析,蛋白质溶解度,不同蛋白质溶解度与离子强度的关系,蛋白质种类不同,盐析所用的无机盐量也不同,对于特定的蛋白质,一定操作条件下产生沉淀时的
6、无机盐浓度范围都是一定的,即具有一定的蛋白质盐析分布曲线。,蛋白质沉淀的速度可用-对盐饱和度(P)作图来表示:,dS,dP,蛋白质溶解度随(NH4)2SO4 饱和度而变化的速率,P,利用不同蛋白质盐析分布曲线在横轴上的位置不同,可采取先后加入不同量无机盐的办法来分级沉淀蛋白质。,2.蛋白质浓度的影响,蛋白质浓度不同,沉淀所需无机盐用量也不同。随浓度提高,盐用量减少。,分级沉淀:将溶液稀释,使重叠曲线拉开距离制取成品:提高蛋白质浓度,3.温度的影响,低盐浓度:温度升高,溶解度升高高盐浓度:温度升高,溶解度降低,温度适当提高有利于蛋白质沉淀。高温容易导致蛋白质变性。蛋白质盐析一般在室温下进行,某些
7、温度敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。,4.pH的影响 蛋白质在pI时的溶解度最小,最容易从溶液中析出,因此选择在被盐析的蛋白质的pI附近。耗盐少,蛋白质收率也高,5.操作方式的影响,10,50 60 70 饱和度(%),5,2.5,1,酶活性 U/ml,操作方式对延胡索酸酶盐析的影响,采用间歇方式所需盐量比连续方式少;间歇操作中,用饱和溶液的需盐量比用固体盐的高。,6.盐析法的优缺点,(1)优点:室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放置不会失活,且无机盐不容易引起蛋白质变性失活;非蛋白的杂质很少被夹带沉淀;适用范围广,几乎所有蛋白质和酶都能采用 设备简单,操作方便。,(2)缺点:沉淀物中含
8、有大量盐析剂 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味,产品不能直接用于医药上,盐析法可以作为初始的提取方法,再与多种精制手段结合起来,如采用超滤、凝胶色谱、透析等方法将无机盐去除,就可制得高纯度产品。,二、有机溶剂沉淀法,在蛋白质等生物大分子的水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂,能显著降低蛋白质等生物大分子的溶解度,使其沉淀析出。不同蛋白质沉淀时所需有机溶剂的浓度不同,因此调节有机溶剂的浓度,可以使混合物中的蛋白质分段析出,达到分离纯化的目的。不仅适于蛋白质的分离纯化,还常用于酶、核酸、多糖等的分离纯化。,(一)基本原理,加入有机溶剂后,会使系统(水和有机溶剂的混合液)的介电常数减小,而使溶质分子(如蛋
9、白质分子)之间的静电引力增加,从而促使它们互相聚集,并沉淀出来。水溶性有机溶剂的亲水性强,它会抢夺本来与溶质结合的自由水,使其表面的水化层破坏,导致溶质分子之间的相互作用增大而发生凝聚,沉淀析出。,常用于生物大分子沉淀的有机溶剂:甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等,其中乙醇是工业上最常用的,(二)影响沉淀效果的因素,温度pH中性盐浓度金属离子,1.温度的影响,有机溶剂存在下,多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著的减小,因此低温下(最好低于0oC)沉淀得完全,有机溶剂用量可减少。实际操作中:有机溶剂与水混合时,会放出大量的热量,使溶液的温度显著升高,从而增加对蛋白质的变性作用。,整个操作过程应在低温下进行
10、。具体操作时:将待分离溶液和有机溶剂分别进行预冷:蛋白质溶液冷却到0oC左右,有机溶剂预冷到-10oC以下 为避免温度骤然升高损失蛋白质活力,操作时应不断搅拌、少量多次加入。使沉淀在低温下短时间处理后即进行过滤或离心分离,接着真空抽去剩余溶液或将沉淀溶入大量缓冲溶液中以稀释有机溶剂,旨在减少有机溶剂与目的物的接触。,温度的控制应根据蛋白质的稳定性而不同,稳定性较差的物质,冷却至低温是必要的;但对于稳定性较好的物质,如淀粉酶,温度不需过低,10-15oC。,2.pH的影响,在等电点时蛋白质溶解度最低,因此有机溶剂沉淀时溶液pH多控制在蛋白质等电点附近。pH的控制必须考虑蛋白质的稳定性:某些酶的等
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