《核酸与核苷类药物》PPT课件.ppt

《《核酸与核苷类药物》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《核酸与核苷类药物》PPT课件.ppt（72页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第 12 章 核酸与核苷类药物,第一节 概述,一、核酸与核苷类药物核酸与核苷类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷或者碱基天然的、类似物、衍生物及其聚合物作用：影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢恢复正常代谢或干扰某些异常代谢用途：放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩、肿瘤、病毒病,核酸类物质药物一般可分为两大类：一类具天然结构的核酸类物质，另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物。,前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成与降解以及能量代谢的辅酶，这一类药物有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺氧组织恢复正常生

2、理机能，临床上已广泛使用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎缩等病症的治疗，包括肌苷、辅酶A、GTP、CTP、UTP、ATP、腺苷、辅酶I、辅酶等，多数是生物体自身能够合成的物质，具有一定临床功能，毒副作用小，基本都可经微生物发酵或从生物资源中提取。,后一类药物是治疗病毒感染性疾病、肿瘤的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑核苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。,珍奥核酸,DNA药物,核苷类药物,恩替卡韦,二、核酸与核苷的一般理化性质,核糖（核糖脱氧核糖）核苷 嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）碱基核酸核苷酸 嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）（

3、DNA、RNA）磷酸DNA和RNA是存在于细胞中的正常成分。DNA主要存在于细胞核中，少量（2%）存在于线粒体和叶绿体中；RNA主要存在于细胞质中，少量（10%）存在于核仁、核浆和染色体中。核酸的含量与细胞大小无关，以生长旺盛的组织细胞中含量较多，如动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。,第二节 制备的一般过程与原理,一、RNA的提取与制备 工业用RNA的提取（1）RNA及其工业来源：从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝体青霉素，制霉菌素等菌体。通常在细菌中RNA占525，在酵母中占2.715，在

4、霉菌中占0.7%28。,在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA。很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。（2）高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。,稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使RNA沉淀出来。上法的缺点是制得的RNA Mr较低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90 保持34h破坏

5、酶)。浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%8%）处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。,（3）RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20以下缓慢搅拌30分钟。用6molL HCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液255m1。冷至10以下，6molL H

6、Cl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNA l.8g（纯度80）。,RNA提取实例：提取 中和 HCl 酸化、沉淀HCl酵母 提取液 上清液 RNA NaOH、水 pH 7、离心 pH 2.5、离心,二、DNA的提取与制备 工业用DNA的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100，保温15分钟，迅速冷却至2025，离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀用乙醇

7、、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品含热变性DNA5060。,工业用DNA的提取 提取 热变性 沉淀乙醇鱼精 提取液 纤维状DNA 水、100 冷却、离心 70%-80%（无生物活性）15min 干燥 粗品DNA（热变性后无活性）,具有生物活性DNA的制备 动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离心30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加入2倍量5的（用45%乙醇作溶剂）十二烷基磺酸钠，并搅拌23小时，在02500rpm离心，在上层液中加入等体积的冷95乙醇，离心即可得

8、到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5十二烷基磺酸钠达110体积，搅拌1小时，经5000rpm离心1小时，清液中加入NaCl达1molL，再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制备需在03操作）。,生物活性DNA的制备 提取 洗涤3次 5%SDS 动物内脏 沉淀 沉淀 上层液（肝、脾）生理盐水 生理盐水 再捣碎 离心、30min 沉淀 洗涤、干燥 提取 纤维状DNA 粗品DNA 上清液 95%乙醇 冷乙醇、丙酮 水、5%SDS 离心 沉淀 洗涤、干燥 DNA沉淀 活性DNANaC

9、L、95%乙醇 乙醇、丙酮,三、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 1、酶解法及碱水解法制备核苷酸 酶解法制备脱氧核苷酸 桔青霉产生5-磷酸二脂酶 红酵母产生3-磷酸二脂酶,酶解法制备戊糖核苷酸 我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸）3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。酶解法生产5单核苷酸工艺流程,双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（IG）呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠，商品名简称为（IG），用核酸酶Pl降解RNA可获得GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生产（I十G）工艺。,菌体自溶法生产核苷酸磷酸二酯酶在合适的条

10、件下降解细胞内的RNA可产生5-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5-核苷酸。（1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：,碱水解法生产2，3-混合核苷酸 RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定，很容易生成2，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更不稳定，很易加水分解生成2，3-混合核苷酸。取RNA配成33.5%的水溶液，加氢氧化钠达0.3molL浓度，升温至38，保温1620小时，用6molL盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2，3-核苷酸的降解率达95以上，将2，3-混合核苷酸制成每片含50100mg的片剂，经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均

11、有较好疗效。,发酵法生产核苷酸1、发酵法生产肌苷酸（IMP）肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加2%，鲜度可增加3倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或鸟苷酸钠）后成为第二代特鲜味精。产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径、代谢调控和肌苷酸发酵机制:,积累IMP的主要前提：（1）阻断SAMP合成酶:即选育缺该酶的菌株（嘌呤缺陷型），发酵前期提供适量腺嘌呤，以满足菌体生长；（2）保持 PRA 合成畅通，即后期没有多余腺嘌呤阻遏该步反应；（3）要使IMP渗出胞外，选育对Mn+不敏感菌株；（4）生成的IMP不被降解，恰好原菌株该酶活力低。,2、混合培养法发酵生产鸟苷酸（GMP）:直接发酵法生产GM

12、P必需满足以下条件（1）解除GMP的反馈抑制（与GMP积累相勃）;（2）改变细胞对GMP的透性;（3）不分解生成GMP 只能先合成XMP，后转化为GMP：方法如下：选育鸟嘌呤、腺嘌呤缺陷型菌株，同时解除PRPP转酰胺酶及XMP合成酶的阻遏，积累大量XMP(GMP合成酶及SAMP合成酶缺失）。,XMP转化为GMP菌株的条件:(1)GMP不被分解(2)GMP合成酶活力要强化(抗生素激动剂)(3)增加细胞通透性,半合成法制备核苷酸 由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生成5-核苷酸收率可达90%。例一：肌苷2mmolL悬浮于5

13、ml磷酸三乙酯中，温度控制0，添加氯化氧磷6mmolL，水2mmolL，反应2h，5-IMP摩尔产率达91。例二：鸟苷2mmolL悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温度控制0，添加氯化氧磷6mmolL，水2mmo/L，反应6h，5-GMP摩尔产率达90%。,四、核苷的制备 核苷是多种核苷类药物的原料，在核酸类药物中占主导地位。（1）以核苷及其结构类似物、衍生物为主药物多达几十种；（2）核苷类药物在抗病毒、抗肿瘤、增强免疫方面占重要地位；（3）核苷的发酵水平大大高于核苷酸，所以常做后者的前体物质。1、RNA化学水解法制备核苷：,2、发酵法生产核苷 产率高、周期短、控制容易、产量大。共同特点：（1）使用磷

14、酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌为诱变出发菌株；（2）具有特定标记的有变株；（3）发酵培养时需提供限量生长因素。原菌株：（1）AMP强烈抑制PRPP转酰胺酶的活性，控制总代谢途径；（2）AMP抑制SAMP合成酶；（3）GMP抑制IMP脱氢酶,生产菌株：（1）酶6、7缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累IMP-肌苷（肝炎辅助药）；（2）酶4缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累XMP-黄苷；（3）酶5缺失积累鸟苷。,发酵法生产肌苷（1）肌苷生产工艺（2）发酵工艺条件：碳源为葡萄糖保证充足的氮源磷酸盐的影响Mg+、Ca+有促进作用生长因子腺嘌呤或酵母粉要亚适量最适发酵温度为30-34，pH6.06.2需大风

15、量,高溶氧和低CO2,发酵法生产鸟苷和黄苷 鸟苷产生菌的特征：（1）嘌呤核苷酸分解酶活力强；（2）SAMP合成酶，GMP还原酶缺失；（3）解除AMP、GMP对PRPP转酰胺酶，肌苷酸脱氢酶和GMP合成酶的反馈抑制；,发酵法生产腺苷 以肌苷生产菌（枯草杆菌）为诱变基础菌株。诱变结果：（1）腺嘌呤回复，腺嘌呤酶缺失；（2）黄嘌呤缺陷型，GMP还原酶缺失；（3）抗8杂氮黄嘌呤解除对PRPP转酰胺酶的抑制；（4）发酵不稳定的原因：黄嘌呤缺陷及腺嘌呤酶缺失与回复（菌种传代中）。,第三节 核酸与核苷类药物的制备举例,（一）叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT）1、结构与性质 AZT是1987美国

16、FDA批准的治疗艾滋病的新药。AZT的药理作用是人体内经磷酸化后生成了3-叠氮-2-脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后者取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸参与病毒DNA的合成，含有AZT成份的DNA不能继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的。2、生产工艺 此合成路线的起始原料是胸苷，目前主要是从DNA水解法制备，由于原料来源少，合成路线较复杂，成本很高。,已见报道的胸苷合成方法还有两条途径：从2-脱氧胞苷或2-脱氧鸟苷或2-脱氧腺苷与胸腺嘧啶反应，经大肠杆菌产生的磷酸化酶催化生成胸苷。从鸟苷（300mmolL）与胸腺嘧啶（300mmolL）反应，在欧文氏菌AJZ992所产生的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的催化

17、下生成5-甲基尿苷，然后经化学法合成胸苷。,（二）阿糖腺苷（Adenine arabinoside）1、结构与性质 阿糖腺苷的化学名称为9-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称腺嘌呤阿拉伯糖苷。早在1960年就在实验室合成了阿糖腺苷，1969年美国用Streptomyces antibioticus NRRL3238菌株，1972年日本用Streptomyces hebacecus 4334菌株发酵法分别制备了阿糖腺苷。1979年用从EColi中分离得到的尿嘧啶磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶，以固相酶的方法将阿糖脲苷转化为阿糖腺苷。,2、生产工艺 酶-化学合成法 最新的阿糖腺苷的合成法是酶-化学合成法：用

18、尿苷为原料经氧氯化磷和二甲基甲酰胺反应，生成氧桥化合物，在碱性水溶液中水解成阿糖尿苷，然后利用阿糖尿苷中的阿拉伯糖经酶法转化成阿糖腺苷。经选育从阿糖尿苷酶法合成阿糖腺苷的优秀菌株是产气肠杆菌（Enterbacteraerogens），这株菌能产生尿苷磷酸化酶（Upase）和嘌呤核苷磷酸化酶（Pynpase），用这个菌株的休止细胞作为酶源，从阿糖尿苷和腺嘌呤能高效地合成阿糖腺苷，菌体也可制成固定化细胞进行连续生产。,以5-AMP为原料的化学合成,3、作用与用途 阿糖腺苷是近年来引人注目的广谱DNA病毒抑制剂，对单纯疱疹、型，带状疱疹，巨细，牛痘等DNA病毒，在体内外都有明显抑制作用。目前认为，阿

19、糖腺苷是治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。阿糖腺苷在体内受激酶作用生成的阿糖腺三磷，是脱氧腺三磷（dATP）的拮抗物，从而阻抑了以dATP为底物的病毒DNA聚合酶的活力。而且阿糖腺三磷对于病毒DNA聚合酶的亲和性比宿主细胞的同一个酶的亲和性高。因此这个药物对于抑制病毒具有较高选择性。,（三）三氮唑核苷1、结构与性质 三氮唑核苷商品名病毒唑，对DNA病毒，RNA病毒都有广泛作用。本品为白色结晶，熔点174176，易溶于水。这个化合物经X线解析，它的立体结构与腺苷、鸟苷非常类似，在体内被磷酸化成三氮唑核苷酸，抑制肌苷酸脱氢酶阻断鸟苷酸的生物合成，从而抑制病毒DNA合成。它的另一特点是对病毒作用点多

20、，不易使病毒产生抗药性。,2、生产工艺 酶合成法 使用产气肠杆菌，以（尿苷）肌苷和TCA为底物可以用酶法简易地合成三氮唑核苷。,采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段使用嘧啶核苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶。,（四）阿糖胞苷（Cytarabine，Cytosine arabinoside，Arabinosyl Cytosine，Aracytidine）1、结构与性质 阿糖胞苷又称胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的组成部分是阿拉伯糖。白色或类自色结晶性粉末，无臭，易溶于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。阿糖胞苷进入体内转变为阿糖胞苷酸，抑制DNA聚合酶，阻止胞二磷转变为脱氧胞二磷从而抑制DNA的

21、合成，干扰DNA病毒繁殖和肿瘤细胞增殖。只能注射。,2、生产工艺 以5CMP为原料的合成法（1）工艺路线：,（2）工艺过程：水解：并加入处理好的6.5L 氢氧化镧凝胶，总体积为7.5L，升温至90，在不断搅拌下，于pH9下进行水解。在不同的反应时间内，均匀取出2mL凝胶溶液，离心分离，取上清液5至10l，pH9.2电泳分析，检查水解程度。氧桥化：氧桥化后总OD光谱高峰位置移至264nm（pH2）氨解：使氧桥断裂3，5-乙酰基脱落。成盐：2盐酸-甲醇 以葡萄糖酸钙为原料的合成路线,（五）聚肌胞苷酸（聚肌胞）（Poyinosinic，Polycytidylic Acid，Poly1：C）1、结构与

22、性质 1967年美国人Field发现聚肌胞是干扰素诱导物，而且具有广谱抗病毒作用。本品是人工合成的干扰素诱导剂，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚核苷酸。本品可溶于0.85氯化钠溶液。2、生产工艺70年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺如下：底物5-核苷二磷酸吡啶盐的制备,（3）固定化多核苷酸磷酸化酶，将分离纯化的酶液滴加入冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷酸磷酸化。,3、Poly I：C制备（1）底物预处理：CDP吡啶盐转成锂盐，IDP转成钠盐。（2）酶促反应：（每毫升反应液含molL数）IDP或CDP 15；Tris 150；MgC126；EDTA 1；聚合酶5单位，pH9.

23、0，37，34小时。用盐酸调pH1.52.0，使PolyI（或Poly C）沉淀，立即离心。此后在磷酸液冲液中溶解，等摩尔Poly I与Poly C混合，生成产品。,3、作用与用途 本品具有抗病毒，抗肿瘤，增强淋巴细胞免疫功能和抑制核酸代谢等作用。本品注入人体诱导产生干扰素。临床已试用于肿瘤、血液病、病毒性肝炎及痘类毒性感染等多种疾患。,胞二磷胆碱（CDP-胆碱）1、结构与性质 胞二磷胆碱其化学名称为胞嘧啶核苷-5-二磷酸胆碱钠盐本品为白色无定形粉末，易吸湿，易溶于水，几不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂。1水溶液pH2.53.5，注射液pH7.0。,2、生产工艺 酶合成法 胞二磷胆碱由微生

24、物菌体所提供的酶系催化胞苷酸和磷酸胆碱而合成，国内使用啤酒生产中废弃的酵母，反应体系为：磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲液（pH8.0）200molml，CMP 20molml，磷酰胆碱 30molml，葡萄糖 1000molml，MgSO4.7H2O 20molml，酵母泥 550mgm1。上述反应体系于28保温20小时，胞二磷胆碱对胞苷酸的收率为80。,粘性红酵母发酵法 国外发现一株粘性红酵母可高产胞二磷胆碱。菌体培养基（gL）：葡萄糖50；多胨5；酵母膏2；KH2PO4 2；（NH4）2HPO4 2；MgSO4.7H2O 1；pH6.0，经28，22h培养，收集菌体，菌体经0.2molL磷酸缓冲液

25、pH7.0洗涤，备用。产生胞二磷胆碱的反应体系（gL）：葡萄糖140；MgSO4.7H2O 6；5CMPNa2 20；磷酸胆碱20；析干菌体50；反应体系中保持磷酸缓冲缓pH7.0、0.2molL，30，28小时产胞二磷胆碱9.8gL，对5-CMP收率92.5。,提取工艺：反应液离心除去菌体，用0.5molL KOH调pH8.5，上dowex 12（酸型）树脂，水洗后用甲酸梯度洗脱，在0.04molL甲酸洗脱液中收集产品，含胞二磷胆碱溶液上活性炭柱，丙酮-氨水溶液洗脱，减压浓缩，乙醇中结晶。3、作用与用途 胞二磷胆碱是卵磷脂生物合成的前体。当脑功能下降时，脑组织内卵磷脂含量显著减少。本品能促进

26、卵磷脂生物合成，兴奋脑干网状结构，特别是上行网状联系，提高觉醒反应，降低“肌放电”阈值，恢复神经组织机能，增加脑血流量和脑耗氧量，从而改善脑循环和脑代谢，大大提高患者的意识水平。,临床用于减轻严重脑外伤和脑手术伴随的意识障碍，治疗帕金森氏症，抑郁症等精神疾患。由于胞二磷胆碱是在ATP存在下参与磷脂的合成反应，故合用ATP可提高本品疗效；用于脑外伤，脑出血患者可合用止血剂和防水肿药；用于震颤麻痹可合用L-多巴；用于精神病可合用镇静药。,1、酶合成法：啤酒酵母泥 CMP+磷脂酰胆碱 胞二磷胆碱 Ph8，282、粘性红酵母发酵法：粘性红酵母5-CMPNa+磷酸胆碱 胞二磷胆碱 pH7，303、提取工艺：离心 KOH 离子交换 洗脱反应液 去菌体 洗脱液 Ph 8.5 甲酸,活性炭吸附 减压、浓缩 结晶 洗脱液 成品丙酮、氨水洗脱,