《核型与带型分析》PPT课件.ppt

《《核型与带型分析》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《核型与带型分析》PPT课件.ppt（73页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第五章 染色体核型与带型分析,第一节 染色体核型（Karyotype）分析的意义与内容,1 概念：1.1核型 是动物、植物、真菌等真核生物的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的细胞内具有的相对恒定特性的单倍或双倍染色体组在有丝分裂中期的表型,是染色体数目、大小、形态特征的总和。,1.3 染色体核型分析 是鉴别染色体进行配对分类的基木技术，是在对染色体进行测量计算的基础上,进行分组、排队、配对,并进行形态分析的过程。,1.2 核型模式图 将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画下来，再按长短、形态等特征排列起来的图称为核型模式图，它代表一个物种的核型模式。,人染色体组型模式图,2 染色体核型

2、分析的意义：,不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。因此，染色体核型分析是生物种质资源遗传性研究的重要内容，在动植物分类和生物进化研究中也得到广泛的应用；,对于高危人群的孕妇，羊水细胞染色体分析是目前惟一能够确诊胎儿是否有染色体病的检查方法，对避免患儿出生有着具有十分重要的意义。新生儿进行染色体核型分析，可以对染色体存在异常的某些患儿及早采取干预措施。疾病诊断：肿瘤细胞的核型分析已被应用于肿瘤的临床诊断、预后及药物疗效的观察。绝大多数慢性粒细胞性白血病人的骨髓细胞中都可以发现有一个小的特殊染色体。,3 核型分

3、析的内容：染色体核型分析主要包括染色体长度、染色体臂比、着丝点位置、次缢痕等。,3.1 染色体长度：染色体的长度差异有两种，一种是不同种、属间染色体组间相对应的染色体的绝对长度差异，一种是同一套染色体组内不同染色体的相对长度差异。绝对长度通常在放大的照片或图象上以微米（m）进行测量，然后按下式换算：染色体绝对长度=放大的染色体长度（m）1000/放大倍数,绝对长度不大稳定，这是因为预处理条件和染色体的缩短程度难以完全相同，即使同一个体的不同细胞的染色体，缩短程度也常常不同。因此，绝对长度只有在染色体大小差异明显的种或属间的比较才有价值。而对于染色体大小差异不明显的材料间的比较，常常以相对长度作

4、为量度染色体的标准。染色体相对长度是以百分比表示，通常采用Levan（1964）的公式计算：染色体相对长度=（染色体长度/染色体组总长度）100%由于相对长度排除了因技术原因引起的染色体短缩程度不同所产生的差异，因此，相对长度值是一个较稳定的可比较的数值。而绝对长度则往往只记录变异范围。,臂比：不同属、种，以及不同变种之间，因染色体变异，会引起同源染色体长臂与短臂不一样，这通常用染色体臂比来进行比较。通用公式如下：染色体臂比=长臂（L）/短臂（S）由于染色体长臂和短臂不一，就表现出着丝点位置不同。,此外，在核型分析中，次缢痕或核仁组成区（NOR）和随体（SAT）的数目、分布和大小的差异，常常成

5、为区分某些近缘种或属的主要特征，因此，它们识别与判断极为重要。例如，葱、洋葱和大蒜的染色体数目和基本形态都相近似，但是，其随体的数目、大小和位置明显不同，而易于区分。,4 核型的描述4.1 常用的符号与术语,4.2.1 染色体数目异常的核型描述 首先是书写染色体总数，加一个逗号，接着写出性染色体的组成，然后写出染色体的异常。“”和“”号当其放在相应的符号之前，表示增加或丢失了整条染色体；当其放在相应符号之后，则表示染色体长度的增加或减少。例如：47，XX，21为一个女性先天愚型的核型，有一条额外的21号染色体；46，XY，5p-表示一个5号染色体短臂长度减少的男性核型。,4.2 核型描述方法,

6、4.2.1 染色体结构异常的核型描述,末端缺失：46,XX，del(1)(q21)（简明型）46,XX,del(1)(pterq21：)（详尽型）表示1号染色体长臂2区1带处断裂造成了该处以远的末端缺失，异常的染色体由完整的短臂和着丝粒与1q21带之间的部分长臂构成。,等臂染色体46，X,i(Xq)46,X,i(X)(qter cen qter)女性核型，有一条正常的X染色体和一条X染色体长臂形成的等臂染色体（在细胞分裂期间，染色体的着丝粒区在水平方向上发生断裂，使染色体的两个臂分开，从而形成两条等臂染色体）。,等臂染色体,5 人类染色体的核型分析,染色体分组 A,B,C,D,E,F,G七组A

7、:13；最大，中(1,3号)，亚中(2号)，1号常见副缢痕，可鉴别B：45；次大，亚中，难鉴别C：612,X，中等，亚中，9号常见副缢痕，难鉴别E：1718；小，中(16号)，亚中(17,18号)，16号可鉴别,17、18难鉴别F：1920，次小，中，难鉴别G：2122,Y，最小，近端，21,22号有随体,Y无，难鉴别,女性未显带核型，较难鉴定,第二节 染色体带型分析以及染色体的分区与表示法,1 染色体带型的概念 借助细胞学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带型。,普通染料直接染色在染色体

8、标本上。由于整条染色体都均匀着色，在显微镜下只能看到染色体的外形，看不清其内部结构，只能根据染色体的相对长度和着丝粒位置等外形体征来识别染色体。这种染色方法只能正确地识别出第1、2、3、16、17、18号及Y染色体，不能正确地识别出其他染色体及染色体上的不同片段。对各条染色体的微小结构变化，如缺失、易位等也不能检出。所以，对许多染色体异常，特别是染色体结构变化的研究，受到很大的限制。,2 染色体染色技术2.1 普通染色,染色体普通染色图,2.2 多种显带技术a）Q显带：70年代初，瑞典细胞化学家Caspersson首先应用荧光染料喹吖因氮芥（quinacrine mustard）处理染色体标本

9、，发现在荧光显微镜下每条染色体出现了宽窄和亮度不同的纹，即荧光带，富含AT碱基的DNA区段表现为亮带,富含GC碱基的区段表现为暗带，而各条染色体有其独特的带型，由此可以清楚地鉴别人类的每一条染色体。缺点是标本易褪色,不能做成永久性标本片。,人类Q核型（Q带与G带相似）,b）G显带（G banding）：染色体标本用热、碱、蛋白酶等预处理后，再用Giemsa染色，可以显示出与Q带相似的带纹。在光学显微镜下，可见Q带亮带相应的部位，被Giemsa染成深带，而Q带暗带相应的部位被Giemsa染成浅带。这种显带技术称为G显带。G显带克服了Q显带的缺点，G带标本可长期保存，而且可在光学显微镜下观察，因而

10、得到了广泛的应用，是目前进行染色体分析的常规带型。,人染色体G-带核型,男性G显带中期分裂相,c）R显带（R banding）:所显示的带纹与G带的深、浅带带纹正好相反，故称为R带（reversed band）。G带浅带如果发生异常，不易发现和识别，而R显带技术可以将G带浅带显示出易于识别的深带，所以R显带对分析染色体G带浅带部位的结构改变有重要作用。,d）C显带（C banding）：专门显示着丝粒的显带技术。C显带也可使第1、9、16号和Y染色体长臂的异染色质区染色。用NaOH或者Ba（OH）2预处理标本后，再用Giemsa染液染色，可以特异地把着丝粒和副缢痕处染成深色，因而，C带可用来分

11、析染色体这些部位的改变。,人类C带核型（显示着丝粒异染色质）,e）T显带（T banding）：专门显示染色体端粒的显带技术，用来分析染色体端粒:87高温处理、pH=6.7姬姆萨染色可以使染色体末端区域着色，所呈现的带型称为T-带，可以确定端粒断点的精确位置。,f）N显带（N banding）：专门显示核仁组织区的显带技术,将核仁形成区染得很深，染色体的其它部分则是淡染。g）Ag-NOR带：显示核仁形成区的显带技术，试剂为甲酸-硝酸银混合液，使该具有转录活性的核仁形成区染成黑色。,h）高分辨显带（high-resolution banding）：分裂中期一套单倍染色体一般显示320条带。70年

12、代后期，采用细胞同步化方法和改进的显带技术，获得细胞分裂前中期、晚前期或早前期的分裂相，可以得到带纹更多的染色体，能显示550-850条带，甚至2000条带以上。高分辨显带技术，对染色体的分析达到了亚带（subband）的水平。使我们能够确认那些更为微小的染色体结构改变了。,i）SCE（sister chromatid exchange）显示方法：5-BrdUT,优缺点：染色体显带技术能够识别不同的染色体，从染色体水平上了解许多疾病的遗传变异，但是受到分辨率（超过3Mb的DNA才会识别）的影响，检测出像染色体微缺失的综合症的微小染色体变异可能性较小；只能分析中期分裂相细胞；而且，由于许多肿瘤是

13、实体，染色体重组非常复杂，无法通过显带技术得到全部的核型。,显带染色体模式图（巴黎会议，1971）,1971，单倍染色体带纹数为320条；后来，可以显示出550、850或者更多的条带，这种染色体被称为高分辨显带染色体（high resolution banding chromosome，HRBC）,3 染色体的分区与表示法,已经划分好的带可以再细分，在原来的带号数之后加一个小数点，并写明每一个亚带的号数，其编号原则仍按照从着丝粒往臂端序贯编号。如图：细分之前的编号：1p1，表示1号染色体短臂1区，而1p1.1则表示1号染色体短臂1区1亚区。依此类推，1p11.1则表示在1亚区上有细划分的区带。

14、1p11.11则表示1p11.1上的次亚带，后面不再加标点，,人类1号染色体带的识别图解,注意：小的编号是靠近着丝点一端的。,显带染色体：用特殊的染色方法使染色体沿其长轴显示出明暗交替或染色深浅不同的横纹带。,4 光谱核型分析(Spectral karyotyping,SKY),1996 年 Schroch等首次描述了SKY技术。应用5种荧光素同时标记24条人染色体，制成染色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，CC成像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处理，46条染色体形成具有不同颜色的核型影像,可用以分析各种染色体异常。优势：特异性和分辨率比传统的显带技术高 一次杂交即可分辨人的24条染

15、色体,人染色体光谱核型分析,乳腺癌细胞染色体复杂的畸变,5.分子细胞遗传学与核型分析5.1 原位杂交（In situ hybridisation）标记的核酸探针变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性，在不改变被分析对象，即维持其原位的前提下对靶核酸进行分析。,5.2 荧光原位杂交(Fluorescent in situ hybridisation，FISH)核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通过显微镜观察。,荧光原位杂交，据标记物不同可分为：间接法：用生物素或地高辛标记探针，通过与荧光染料结合的抗生物素或抗 地高辛抗体将信号放大而进行检测。直接法：直接用荧光素标记，如Vysis 公司的FISH探

16、针。,M-FISH技术:1996，M-FISH技术得以建立。运用几种不同的荧光染色，将人类的22对染色体核2条性染色体着色染成24种不同的颜色组合，原理是：将几种荧光染料混合后产生的颜色要多于所使用的混合染料数目，理论上，如果使用n种染料，则会检测出2n-1个目标。需要特殊的软件来识别虚拟颜色代表的不同荧光组合。,荧光标记探针的优点：不对环境构成污染灵敏度能得到保障可进行多色观察分析，可同时使用多个探针，缩短因单个探针分开使用导致的周期过长和技术障碍。,荧光原位杂交原理示意图,荧光原位杂交过程,DAPI4,6-二联脒-2-吲哚苯,FITC异硫氰酸酯,TRITC硫氰酸四甲基罗丹明,人染色体不同荧

17、光素染色结果,人类全着丝粒探针（pan-centromeric，Green)和全端粒探针（pan-telomeric，Red),5.3 染色体涂染(Chromosome painting)又称为多重荧光原位杂交(multiplex-fluorescence in situ hybridisation,M-FISH)将荧光原位杂交与染色体原位抑制杂交技术相结合，用单链DNA封闭基因组重复序列，以减少非特异性杂交信号，增强特异性杂交的强度，并用染色体特异性DNA库作为探针池，以不同荧光染料涂染整条染色体或染色体区段的新技术。,染色体涂染技术的优点：可同时检测多个染色体，一次杂交即可检 测人的24条

18、染色体；可检测简单及复杂的染色体重排。,小麦簇毛麦F1 代染色体间易位,染色体涂染显示人染色体组,5.4 比较基因组杂交 Comparative Genomic Hybridization(CGH),原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于肿瘤的检测及其基因组分析 是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的工具。,比较基因组杂交原理示意,肿瘤DNA和对照DNA在染色体上的相对结合量取决于两种DNA标本中相应杂交序列的多少 因此可根据不同荧光強度的比率而定量分析肿瘤基因組中DNA的增加或丟失,等比混合,数字化

19、图像,FITC/TRITC 荧光强度比率分析图Ratio image FITC/TRITC,比较基因杂交的应用：主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化物种间染色体同源性比较优势：可快捷检测中期、间期基因组不需预先知道DNA发生改变的部位一次实验即可检出待测样本整个基因组拷贝数的增减,此外，还有染色体显微切割、引物介导的原位标记（原位引物启动技术，PRINS）、SKY、CGH、彩色显带、纤维FISH、阵列CGH等技术也开始应用染色体。,第三节 染色体进化,进化（广义）：是一种变异的过程，它是地球上原已经存在的生命形式产生新的动物、植物和微生物类型的过程，进化形成新的物种。,物种形成的主要途径：物种转型

20、（线系进化）：自体物种形成；种的数目减少（两个中融合）；种的数目增加（真种）瞬时物种形成（通过不同个体形成）遗传变异：无性生殖的种中发生单基因突变；骤变式发生细胞学变异：染色体突变（易位、倒位等结构变异）；同源多倍体（植物）；双二倍体（即异源四倍体）渐变式物种形成）（通过群体形成新种）同域物种形成；半地理物种形成；地理物种形成（异域物种形成）,染色体进化的基础：,一是染色体倍数的变化或通常所称的多倍体。这尤其在植物界，是相当普遍的现象。被子植物的多倍体频率，虽有不同估计，但有7成至8成的物种的进化过程可能涉及染色体的异源多倍化。在动物界，除了鱼类核型演化过程中有比较清楚的例子外，多倍体尚不多见

21、。不过70年代以后在昆虫、两栖类、爬行类也陆续观察到不少多倍体现象。二是染色体结构的改变或称染色体重排。这在动物染色体进化中可能是主要的机制。三是异染色质扩增。结构异染色质的数量与分布，在不同的生物类群可有很大差异。,四是染色体上能够移动位置的部分有可能引发物种向两个不同的方向进化。举例：杂种不育的基因在黑腹果蝇4号染色体上，在中国大陆拟果蝇却转移到了3号染色体上-如果某种基因可以在基因组中来回跳跃，那么会产生一些不能与普通个体杂交的新的群体，如果还有其它物种形成压力，如地理隔离存在的话，这些压力有可能使一个物种向2个方向进化，形成两个新的物种。,人类和动物染色体进化,狗、大鼠、小鼠、鸡的X染

22、色体比较发现：人类X染色体与狗的X染色体上的基因排列基本相同，鼠类的部分X染色体片段有重排-这提示：鼠与人类从共同的祖先分化后，鼠类的X染色体上的丢失了9百万的碱基对的片段，彻底和人类华清了界限。,人类与鸡的基因组之间的比较：大多数人类X染色体短臂上的基因可以在鸡的1号染色体上找到，而大多数在人类X染色体长臂上的基因则可以在鸡的4号染色体上找到，这个发现支持了这一观点-哺乳动物的XY染色体是从其祖先的一对常染色体进化而来。,X染色体-1098个基因，只有54个基因在Y染色体有相应功能的等位基因，Y染色体上只有78个基因。X染色体上的基因属于低密度，提示可能那些需要双拷贝的、编码关键蛋白质的基因

23、在哺乳动物漫长的进化历程中已经从X染色体转移到了其它染色体上，从而保证双拷贝-至少一个坏了还有一个替补。,45年前，人们发现女性的一对X染色体中的一条上大多数基因被关闭-这种修饰称为X-失活，这个机制能降低女性染色体上基因的表达，使之与只有单个X染色体的男性达到平衡，注意男性的Y染色体上基因数目只有78个，比X染色体少1000多个，但是上世纪80年代末期发现这个沉默的染色体的部分基因依然是活跃的，至少15%仍在表达。,男性和女性的染色体：,人染色体的第23对为性染色体。在男性，两个性染色体不一样大，X染色体包含正常生活必需的基因，如编码凝血因子的基因,小的Y染色体上似乎只存在决定男性化的基因。

24、X染色体上基因如有缺陷，因Y染色体不能补偿而必然显现出来。在女性,两个都是 X染色体,彼此同源，因而一方有缺陷，正常的一方有可能补偿。所以只有在女性才谈得到性显性或隐性。,但在女性存在一种特殊情况使疾病表现复杂化。在女性，在发育早期(可能在人胚着床之际)两个 X染色体之一浓缩起来失去功能。在一个细胞里究竟是父方还是母方的X染色体失活，完全是随机的。在体细胞中这种失活是不可逆的，由这个细胞衍生出的一切细胞里都是这同一方 X染色体失活。但在生殖细胞要开始减数分裂时，这个失活 X染色体又复活。如果一方性染色体含有缺陷基因，由于这种随机失活的缘故，这个女性实际变成一个嵌合体：一部分细胞正常，一部分细胞

25、异常，而且正常与异常细胞数的比例也是不定的。例如假肥大性肌营养不良是性联隐性遗传病，男性患儿很早就出现症状，很少活到成年。他的母亲往往毫无症状，但也有肢带肌无力和腓肠肌肥大者，这就是因为存在相当数目异常细胞所致。,一个有趣的例子：人类与黑猩猩、大猩猩、猩猩的亲缘关系。人类（Homo sapiens）染色体2n=46；黑猩猩2n=48；大猩猩2n=48；猩猩2n=48。人类的染色体核型与黑猩猩最相似，而和猩猩的差异最大。黑猩猩虽比人类多了2条染色体，但经G带比较发现人类2号染色体可能是黑猩猩两条染色体着丝粒融合的产物，并且有臂间多次倒位，其余的染色体都有很强的同源性，表明人类和黑猩猩的亲缘关系较

26、近。,关于熊猫起源的争论：美国国家癌症研究所的WilliamG.Nash采用染色体分带技术对大熊猫和熊的染色体带型进行分析比较发现大熊猫的1号染色体可能是熊的2，3号染色体罗伯逊易位的产物；同样2号染色体与熊的1，9号染色体同源，3号染色体与熊的6，16号染色体同源，从而得出最后的分类建议，大熊猫与熊科中的熊有亲缘关系，小熊猫与浣熊科的浣熊有亲缘关系，将它的各自主为亚科。,日韩联合研究小组发现，黑猩猩与人类的DNA碱基序列的差异为1.78%，大于基因组碱基序列的整体差异（98.77%的同源性，即差异为1.23%），表明人类染色体的进化速度比其它染色体快。黑猩猩的Y染色体中不存在CD24L4基因

27、，这一基因指导合成人类免疫细胞表面的蛋白质。研究人员认为，约500万年前，人类和黑猩猩由共同的祖先形成分支开始独立进化后，人类的Y染色体才获得了CD24L4基因，这一基因或许可以解释人类与黑猩猩在应对传染病的免疫功能方面的差异。,基因组进化,细胞内的含量与进化过程存在密切关系：第一类：细菌的含量最低（）；第二类：真菌不足；第三类：为大多数动物和某些植物，包括海胆、两栖动物、鸟类和哺乳动物；第四类：细胞含量大于，包括蝾螈、某些鱼类和许多植物。,基因组进化的机制：多倍体可能是一种增加含量的机制；DNA重复序列是生物进化的标点符号，进行复制、删除和重排。Alu重复片段是人类和灵长类进化速度的决定因素，近2%的差异的一个关键因素是：Alu DNA重复片段。这些片段十分不稳定，很容易引起基因的突变和重排。假基因能够累积导致基因失活，也可以作为新基因起源的基础，是高等真核生物进化的重要因素之一（假基因是多基因家族的成员，其拷贝数、功能不受到限制，有潜力进化成有功能的基因）。,