《放射免疫分析技术》PPT课件.ppt
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1、放射免疫分析技术,(Radioimmunoassay,RIA),核医学,治疗:肿瘤、甲亢等诊断 体内PET、SPECT、放射免疫成像等 体外放射免疫分析(RIA),标记免疫分析技术,用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法特点:敏感性高,反应时间短,可用仪器检测结果三大标记免疫分析技术:放射免疫、荧光免疫、酶免疫 检测方法 检测范围生化、常规免疫 mgg(10-3 10-6 g)荧光免疫、酶免疫 gng(10-6 10-9 g)放射免疫、发光免疫 ngpg(10-9 10-12 g)PCR pgfg(10-12 10-15 g),一、放射免疫分析技术(Radioimmunoassay,RI
2、A),女科学家 R.Yalow(美,1921)1950末发明(胰岛素),1977年获诺贝尔医学奖1.基本原理(1)竞争结合分析:Ag+Ab AgAb*Ag+Ab*AgAb(2)IRMA(免疫放射分析):2.常用标记核素:(1)125I:射线,半衰期 60 天(2)3H:射线,半衰期 12.3 年3.测量仪器(1)计数仪(2)液闪仪,4.基本试剂,(1)标准品与质控品a.意义:放射免疫定量分析的尺度、质量控制的依据b.要求:化学结构上与待测物有相同的化学结构 化学纯度上对竞争反应有干扰的杂质的含量低 含量准确 注意不变质与降解:在运输、保存时尤应注意;注意有效期c.种类:国际标准、国家标准、企业
3、标准,(2)标记物,a.对标记物的要求 比活度高:即单位物质的放射性强度高 生物活性及免疫活性与标记前改变小 放射化学纯度高:应 95%稳定性好:标记的同位素不易脱落,b.标记方法:,氯胺-T 法:最常用的 125I 标记法,I 与酪氨酸共价结合,方法简便,但易造成蛋白质的损伤 乳过氧化酶法:Iodogen(氯甘脲)法:固相法,标记率较高,损伤小,反应时间长 置换法:3H 最常用c.标记产物的纯化:常用 Sephadex 层析,也可用硅胶 G 薄板层析或 HPLC 分离d.标记产物的鉴定:常用 RIA 法 最大结合百分率 标准曲线比较法e.半抗原的标记:必须先连接载体,常用牛血清白蛋白(BSA
4、),再对载体作标记,(3)特异性结合抗体,a.对特异性结合抗体的要求:亲和力(affinity)高:指单个抗体分子与抗原决定簇特异结合的能力,用 K 值表示,反映灵敏度 特异性高:与待测抗原的结合力高,而与待测抗原类似物的结合能力(交叉反应)低 滴度(效价)高:指结合 50%标记抗原时抗体的稀释度高 稳定性好:能长期保存,化学性质、效价稳定b.抗体的制备 选择合适的免疫动物:兔、鼠、羊 应用佐剂:福氏完全佐剂与不完全佐剂(羊毛脂、石蜡油+卡介苗)选择合适的免疫方法:剂量、接种途径(腹股沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点)、间隔时间(加强)与次数,c.抗体的纯化,去除杂抗体:用抗原吸附法 提取特异性 I
5、gG:先用盐析法粗提,再用离子交换层析或亲和层析纯化d.抗体的鉴定 鉴定内容:效价、亲和力、特异性 鉴定方法:效价(琼脂单扩)、特异性(琼脂双扩)、RIA e.单克隆抗体的使用:用于 IRMA 或 RIA,特异性高 不一定优于传统的多克隆抗体,5.竞争性放射免疫分析法的建立,(1)反应方式a.平衡法:标记抗原与待测抗原、特异性抗体同时加入温育b.顺序法:先加入待测抗原、特异性抗体温育一段时间后再加入标记抗原。可提高反应灵敏度c.STAT 法:反应未达平衡时即测定,较难控制反应条件(2)反应体系a.缓冲液:常用 0.050.1 mol/L pH 7.47.5 磷酸或 Tris-HCl 缓冲液。根
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