《操作技术》PPT课件.ppt

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1、第四章 操作技术,目的要求：1.熟练掌握组织培养相关的灭菌方法和无菌操作技术；2.掌握培养和驯化的方法和步骤；3.基本掌握污染、褐变和玻璃化原因及采取的对策；4.试管苗增殖率的估算和组培计划的安排。,第一节 灭菌和接种,第四章 操作技术,第二节 培养和驯化,第三节 组培常见问题及对策,第四节 试管苗增殖率的估算,总结及复习思考题,第五节 快速繁殖工作的计划安排,第一节 灭菌和接种,一、灭菌二、无菌操作四、接种(融入实践课),二、灭菌,(一)灭菌与消毒的区别,(二)灭菌方法,消毒：杀死、消除或抑制部分微生物，使之不发生作用。,灭菌：用物理或化学方法，杀死物体表面和孔隙内一切微生物或生物体，即所有

2、生命的物质全部杀死。,灭菌和消毒的区别是什么？,(一)灭菌与消毒的区别,1.培养基灭菌2.玻璃器皿灭菌3.接种工具灭菌4.实验服、口罩、滤纸灭菌5.接种室灭菌6.接种材料灭菌7.物体表面灭菌8.培养室灭菌,(二)灭菌方法,1.培养基灭菌,高压湿热灭菌某些激素、维生素采用过滤灭菌,1.外桶 2.锅盖3.安全阀4.排气阀5.气压表6.内桶7.排气软管8.支架,手提式高压湿热灭菌锅,自动高压湿热灭菌锅,电源,水位指示灯,温度、压力显示窗,温度压力设置钮,压力表,放汽阀,培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间,容器体积(mL)121灭菌所需最少时间(min),20-50 15,1000 30,250-50

3、0 25,75-150 20,过滤灭菌,滤膜0.45um以下,1.过滤器先灭菌，灭菌温度不超过121。2.溶液先进行初滤(滤膜0.65um),2.玻璃器皿灭菌,h湿热灭菌：121,20-40min接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。,3.接种工具灭菌,h用前湿热灭菌：121,20-30min接种前用酒精棉球擦试，浸入95%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。,湿热灭菌：121,20-30min实验服灭菌后置于缓冲间或密封好。,4.实验服、口罩、滤纸灭菌,5.接种室灭菌,紫外灯照射(接种室、超净台、接种箱)：波长260nm，距离小于1.2m，20-30min。臭氧灭菌机：1-2h熏蒸

4、灭菌：5-8ml/m3甲醛+5g/m3 高锰酸钾；冰醋酸；1-3%高锰酸钾或3%来苏儿。接种台喷雾消毒：75%酒精。,用化学灭菌剂消毒常用化学灭菌剂灭菌步骤：流水冲洗或洗衣粉漂洗用化学灭菌剂浸润灭菌，最好加吐温-80等表面活性剂(灭菌液的0.5%)，一般70%酒精30S，0.1-1%升汞5-8 min。无菌水冲洗3-10次。注：灭菌液要浸没材料,6.接种材料灭菌,灭菌剂 使用浓度 持续时间 去除难易 效 果,次氯酸钙 9-10%5-30min 易 很好,次氯酸钠 2%5-30min 易 很好,氯化汞 0.1-1%5-8min 较难 最好,抗菌素 4-50mg/L 30-60min 中 较好,7

5、.物体表面灭菌,灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌 范围：桌面、墙面、双手、材料表面消毒剂：70%酒精；1-2%来苏水；0.25-1%新洁尔灭；洗衣粉；吐温-80,8.培养室灭菌,新建培养室用前一定要彻底熏蒸1次。隔2-5天用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰酸钾擦架1次。,二、无菌操作,无菌操作录像,思考：如果不进行无菌操作，其后果是什么?,第二节 培养和驯化,一、培养二、移栽驯化(融入实践课),1.培养含义2.培养方法3.培养步骤4.外植体成苗途径,一、培 养,将植物材料置于培养室，提供光照、温度条件，使之生长，分裂分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程,一、培养含义,固体培养,养分分布不均，生

6、长速度不均，常有褐化、中毒发生。,养分分布均一，生长速度均一，振荡培养能保证氧气供应。,液体培养,二、培养方法,1.初代培养,2.继代培养,3.生根培养,三 培养步骤,一.初代培养,目的：获得无菌材料和无性繁殖系。无性繁殖系包括：芽丛、不定芽、胚状体、原球茎。,培养基：诱导或分化培养基。培养基中CTK多，IAA少。,类型（根据发育方向）：丛生芽的发育不定芽的发育胚状体的发育 原球茎的发育,丛生芽的发育,顶芽,腋芽,微型扦插,丛生芽的发育,顶芽,CTK刺激,带芽的茎切段,侧芽,接种培养,形成的茎梢节长，直立向上呈小灌木丛状,获得较多嫩茎梢,茎段培养继代扩繁,试管苗,生根培养,无愈伤组织产生,初代

7、,继代,不定芽的发育,不定芽的发育,脱分化,分化,愈伤组织,芽、芽丛,切割芽丛继代培养,大量芽丛,试管苗,生根培养,外植体,初代,继代,石龙芮下胚轴培养产生胚状体过程,体细胞胚状体的发育,体细胞胚状体的发育,外 植 体,特点：数量多，速度快，结构完整，成苗率高,愈伤组织,小孢子,游离单细胞,器官,胚 状 体,试 管 苗,原球茎的发育,缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。,目的：扩繁无根苗，最后达到边繁殖边生根。,扩繁方法：以几何级数增加，可切割茎段、分离芽丛、胚状体、原球茎。,培养基：基本培养基或分化培养基,实质：增殖培养物，为生产成品试管苗做准备。,二、继代培养,三、生根培

8、养,三、生根培养,培养材料,生根,继代培养,初代培养,生根培养基：12或14MS培养基,生根方法与途径,新梢基部浸入50或100ppmIBA液48h,在含IAA培养基中培养46d,移入含IAA的生根培养基培养,其它方法,生根其它方法,延长增殖在培养基培养时间,减少增殖倍率，减少CTK用量,对易生根植物，切割粗壮嫩枝在营养钵中直接生根,生根困难的则在培养基中搭滤纸桥,胚状体发育成小苗不经生根阶段，但需壮苗生根,根、芽,四、外植体成苗途径,胚状体,根、芽,愈伤组织,芽、根,根,芽,外植体,试管苗,原球茎,根、芽,第三节 组培常见问题及对策,（一）污染的原因及预防（二）褐变的原因及预防（三）玻璃化的

9、原因及预防（四）其它(自学),（一）污染,含义：在组培过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。1.污染原因：细菌、真菌为病源菌；污染途径有外植体带菌，培养基及器皿灭菌不彻底，操作人员未遵守操作规程，环境不清洁。,（一）污染,（1）防止材料带菌：避免阴雨天在室外采集外植体；春秋组培；材料预培养。（2）严格外植体灭菌（3）接种用具灭菌彻底（4）严守无菌操作规程（5）保持培养室清洁,2.预防措施,（一）污染,1.褐变的原因（1）植物品种（基因型）（2）生理状态（3）培养基成分（4）培养条件（5）材料转移时间,（二）褐变的原因及预防,2.褐变的防止措施（1）选择适宜的外植体（2）选择合适的

10、培养条件（3）连续培养（4）加抗氧化剂（VC、PVP、牛血清、牛蛋白）（5）加0.10.5%活性炭,（二）褐变的原因及预防,（三）玻璃化的原因及预防,1.含义：离体培养物的嫩茎或叶呈半透明水渍状。为生理失调症。,2.原因：细胞过程中的环境变化引起。导致玻璃化的因素有以下几方面：（1）激素浓度（尤其CTK）增加或CTKIAA高（2）琼脂浓度低（3）光照时间大于15h（4）温度低（5）通风条件不好（6）培养基离子种类及比例不适宜,（三）玻璃化的原因及预防,3.预防措施：（1）适当控制培养基中无机盐成分，适当提高蔗糖和琼脂浓度，减少含氮化合物的用量，降低培养基的水势。（2）适当降低CTK和GA的浓度

11、。考虑加入适当的脱落酸。,（三）玻璃化的原因及预防,3.预防措施：（3）增加自然光照，控制光照时间；增加容器通气，控制温度。（4）加入其他物质（如活性炭、多效唑、CCC）。,（三）玻璃化的原因及预防,第三节 试管苗增殖率的估算,Y=xn,年增殖率,全年增殖周期数n=365/每周期天数,每周期增殖倍数,例如：增殖周期为1个月，增殖倍数为3，则年增殖率为312,第四节组培快繁的计划安排,要确定（或限制）增殖瓶数考虑每天增殖与生根的比例。试验后确定，一般3：7。快速繁殖由提高增殖倍数、缩短增殖周期，周年生产三因素决定。实行有效的管理办法，达到人力物力的协调，从而提高生产效率苗数及其它指标的计算,1.存架增殖总瓶数（T）增殖周期内工作日数W*每工作日需用的母株瓶数S2.全年出瓶苗数（P）全年总工作日*平均每个工作日出瓶苗数*（110%损耗率）3.实际年产苗数全年产苗数*移栽成活率,苗数及其它指标的计算,复习思考题：,1.灭菌和消毒有何区别？为什么？2.常用的灭菌方法各有哪些优缺点？3.采用高压蒸汽灭菌时，应注意哪些事项？4.根据发育方向，初代培养可分为几种类型？5.组培成苗途径有几条 6.理解无菌无菌操作含义 7.污染、褐变和玻璃化产生的原因及预防对策是什么？,总结：,