《提取和分离》PPT课件.ppt

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1、第三章,DNA的提取与纯化,基因工程需要三种不同的DNA:总DNA 质粒DNA噬菌体DNA,学习内容：,制备细胞总DNA培养、搜集细菌细胞制备细胞提取物DNA纯化、浓缩从其他生物中提取总DNA质粒DNA提取根据分子大小分离根据结构分离质粒扩增提取噬菌体DNA噬菌体的培养制备非溶源性噬菌体收集噬菌体从噬菌体中纯化DNA 纯化M13 DNA,Figure3.1 The basic steps in preparation of total cell DNA from a culture of bacteria,Basic Steps,1.制备总DNA,基本步骤：1)收集细菌细胞2)打碎细胞，释放内

2、容物3)去掉DNA以外的成分4)DNA溶液的浓缩,1.1培养、搜集细菌细胞,两种类型的细菌培养基的成分：M9培养基：Na2HPO4(6.0)KH2PO4(3.0)NaCl(0.5)NH4Cl(1.0)MgSO4(0.5)Glucose(2.0)CaCl2(0.015)LB培养基：Yeast extract(5)NaCl(10),1.1培养、收集细菌细胞,37C，150-250rpm达到最大浓度2-3109cell/ml,600nm下的OD值，1OD相当于0.8109cell/ml,Figure3.2 Estimation of bacterial cell number by measurem

3、ent of optical density,Figure3.3 Harvesting bacteria by centrifugation,1.2 制备细胞提取物,利用溶菌酶、EDTA或两者结合。溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，消化多聚物。EDTA络合保持细胞结构完整的镁离子，也可以抑制细胞中降解DNA酶的活性。一般溶菌酶或EDTA足以破坏细菌细胞，在提取液中同时还加入SDS。,Figure3.4 Preparation of a cell extract.,Preparation of a cell extract,Figure3.5 Removal of protein con

4、taminants by phenol extraction.,Purification of DNA from a cell extract,1.制备细胞总DNA,1.4 DNA的浓缩与浓度测定最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有Na离子）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀。260nm下测定吸光度，1OD相当于50g双链DNA/ml。A260/A280=1.8，2说明有RNA,Figure3.6 Collecting DNA by ethanol precipitation.,Concentration of DNA samples,Figure3.7 The CTAB method fo

5、r purification of plant DNA,Plant DNA(CTAB法),十六烷基三甲基溴化铵,Figure3.8 The use of an anion-exchange chromatography resin in DNA purification.,阴离子交换层析法,2 质粒DNA提取,质粒DNA的大小（8%）。DNA的构造 Alkaline denaturation Ethidium bromide（溴化二氨乙苯啡啶）-caesium chloride（氯化铯）density gradient centrifugation,2质粒DNA提取,2.1 根据分子大小提取质

6、粒DNAsphaeroplasts裂解细胞可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整。问题：裂解液中不可避免的包含一些染色体DNA质粒分子非常大时，将与染色体DNA共沉淀,Figure3.9 Preparation of a cleared lysate.,Sphaeroplast残壁细胞,2质粒DNA提取,2.2 根据分子构造提取碱裂解法 基本原理：在非常窄的pH范围内，非螺旋化的DNA会变性，而螺旋化的质粒不变性。在裂解液中加入氢氧化钠，调pH值至12.012.5,破坏氢键，使DNA变性。加入酸，变性的细菌DNA进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。另外一个优点，利用SDS（十二烷基磺酸钠）

7、（Sodium dodecyl sulfate，SDS），裂解，KAc中和可以去掉大部分的蛋白质和RNA。,Figure3.10 Two conformation of circular double-stranded DNA.,Two conformation of circular double-stranded DNA,Figure3.11 Plasmid purification by the alkaline denaturation method.,Alkaline denaturation,2质粒DNA提取,2.2 EBCsCl密度梯度离心法在大离心力条件下，形成梯度，生物大分子

8、形成条带。条带的位置取决于其浮力密度。最上部是蛋白质，中间是DNA，下部是RNA。,Figure3.12 CsCl density gradient centrifugation.,CsCl density gradient centrifugation,2.2 EBCsCl密度梯度离心法,EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小，仅有0.085g/cm3。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%。,Figure3.13 Partial unwinding of the DNA double helix by EtBr intercal

9、ation between adjacent base parirs.,EB,EB如何与DNA结合?,Figure3.14Purification of plasmiod DNA by EtBr-CsCl density gradient centrifugation,如何分离质粒DNA？,2质粒DNA提取,2.3 质粒扩增 一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成条件下复制的能力。当细胞增加到足够数目时，加入蛋白合成抑制剂如氯霉素，继续培养。在这个过程中，质粒分子继续复制，但染色体的复制和细胞分裂已经停止，可以获得上千个拷贝。,Figure3.15 Plasmid amplification,Plas

10、mid amplification,Inhibitor of protein synthesis:Chloramphenical,12h,3 噬菌体DNA的制备,当培养物离心时，细菌沉淀到底部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋白就可以获得噬菌体DNA。然而获得大量的噬菌体DNA是一个障碍。每ml菌液可以获得1010噬菌体，但只能产生500ngDNA。,3 噬菌体DNA的制备,3.1 噬菌体的培养自然培养的噬菌体是溶源性的。要获得大量的细胞外噬菌体，必须经过诱导培养使所有的噬菌体都进入裂解周期，使细胞死亡释放噬菌体。,3.1 噬菌体的培养,大部分实验室都使用cI突变的温度敏感突变体。cI基因可以使噬菌体

11、保持整合状态，突变后转变成溶菌性的。在cIts突变体中，cI基因在30C条件下正常表达，在42C时，不能正常表达，产生溶菌性。,Figure3.17 Induction of a clts lysogen（溶原菌）by transferring from 30 to 42,Lysogenic phage,At 30,clts gene protein works,Keep lysogeny（溶原性）:At 42,clts gene protein does not work,produce extracellular phage（细胞外抗菌素）.,Figure3.18 Achieving th

12、e right balance between culture age and inoculum size when preparing a sample of a non-lysogenic phage,Non-lysogenic phage（Lytic),由于缺失修饰，大多数基因工程载体属于此类型。,3 噬菌体DNA的制备,3.3 收集噬菌体 噬菌体颗粒非常小，所以只有高速离心才能沉淀。通常利用PEG沉淀病毒颗粒，形成多聚体。离心可以收集噬菌体，重新溶解在少量的溶液中。,3 噬菌体DNA的制备,3.4 从噬菌体中纯化DNA PEG沉淀物中可能含有少量的细菌裂解物，也可能含有细菌DNA。这些

13、组成部分可以通过梯度离心去掉。除去CsCl后可以获得纯净的噬菌体。然后通过酚抽提或者蛋白酶处理蛋白质外壳。,Figure3.19 Collection of phage particles by polyethylene（聚乙烯）glycol（乙二醇）(PEG)precipitation,Collection of phage particles,Purification of phage,Figure3.20 Purification of phage particles by CsCl density gradient centrifugation.,3.5 纯化M13 DNA,每ml菌液

14、可以获得1012的噬菌体。这意味着少量的培养物可以获得大量的噬菌体，如5ml或更少。由于细菌细胞不裂解，没有细胞裂解物的问题，也不需要CsCl梯度离心。,Figure3.21 Preparation of M13 DNA from an infected culture of bacteria.,Preparationof M13 DNA,Next chap,Next Chap,中国基因工程研究进展*The end！Thanks！,测验一,根据你的理解，回答以下三个问题。1、什么是基因工程技术？基因工程的意义何在？2、简要说明基因工程研究的基本步骤？3、谈谈你对基因工程技术未来的发展趋势及构想。,