《抗体制药》PPT课件.ppt

《《抗体制药》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《抗体制药》PPT课件.ppt（81页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第四章 抗体药物,抗体应用于免疫治疗与免疫诊断免疫缺陷；肿瘤；感染；自身免疫病；超敏反应；移植排斥；炎症。,中和毒素；介导溶解病原微生物；介导溶解淋巴细胞；中和炎症因子；作为靶向性载体。,抗体治疗作用机制：,第一节 概述第二节 单克隆抗体第三节 鼠源性单克隆抗体的改造第四节 基因工程抗体和抗体工程第五节 抗体诊断试剂第六节 抗体治疗药物,第一节 概述,1890年发现白喉抗毒素，建立了血清疗法，开抗体治疗之先河。,传统免疫疗法：例如现在仍在使用的破伤风抗毒素血清。,SARS病毒的免疫治疗：例如钟南山提倡使用的以SARS痊愈病人的血清来治疗SARS病人。,1937年，电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲

2、种球蛋白、乙种球蛋白、丙种球蛋白，那么抗体属于哪一种蛋白？,抗体：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,免疫球蛋白：具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白。,抗体=免疫球蛋白？抗体是生物学上功能的概念，而免疫球蛋白则是化学结构上的概念。抗体 免疫球蛋白，免疫球蛋白 抗体,例如：多发性骨髓瘤细胞也能分泌一些同抗体分子结构类似的球蛋白，即免疫球蛋白。,多克隆抗体：在作为诊断试剂使用的时候，容易发生交叉免疫反应，导致假阳性的发生。,单克隆抗体：高度特异性、均一性、来源稳定可大量生产，主要用于疾病的诊断与治疗。诊断：例如利用单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原、辅助临床诊断或用放射性核素标记

3、的单抗进行肿瘤显像。治疗：例如针对T淋巴细胞分化抗原CD3的单抗，可用作免疫抑制剂抑制器官移植中的排斥反应，现已上市。以单抗为载体的药物可对肿瘤进行导向治疗。,单抗介导的免疫疗法缺陷：（1）鼠原性单抗具有抗原性，容易引起人抗鼠免疫反应，从而降低药物的半衰期。（2）完整的抗体分子太大，不易穿透实体瘤组织。,解决办法：（1）降低单抗的免疫原性（单抗的人原化或基因工程抗体）（2）降低单抗的分子量改进的抗体：改形抗体、单链抗体、单域抗体、超变区多肽（最小识别单位）。这些改进抗体许多原来的鼠源性单抗的生物学活性消失，如激活补体、免疫调理、ADCC等，只保留了同抗原特异性结合的活性。,第二节 单克隆抗体,

4、单克隆抗体的制备,一、抗原与动物免疫二、细胞融合与杂交瘤细胞的培养三、筛选阳性克隆与克隆化四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定五、单克隆抗体的大量制备六、单克隆抗体的纯化,一、抗原与动物免疫,（1）抗原的制备（2）免疫动物的选择（3）免疫方法：I.体内免疫法：免疫原性强、抗原量多时应用。一般在采集脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，使对应的B淋巴细胞克隆受到可靠的最大限度刺激后分裂增殖。II.体外免疫法：应用于制备人源性单克隆抗体，或抗原免疫原性极弱且能引起免疫抑制时使用。具体方法就是制备脾细胞，进行细胞培养，加入抗原刺激，然后分离脾细胞进入融合。,二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养,细胞融合的基

5、本方法：取适量的脾细胞（1X108）与骨髓瘤细胞（23X107）进行混合，在PEG作用下诱导融合，时间控制在2min内，融后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。,PEG：分子量和浓度大，则促融合率高，但粘度和毒性也大。常用分子量为4000，浓度为4050%。为了提高融合率，也常用DMSO来提高细胞接触的紧密性，增加融合率。,融合后的结果：脾-脾，瘤-瘤，脾-瘤及未融合的细胞。在正常培养基中，哪种细胞生长速度最慢？,细胞DNA合成与HAT选择培养基：（1）主途径：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。（2）辅助途径：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌

6、呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。选择培养基：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）。氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖,饲养细胞：能释放生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，常用为饲养细胞。,三、筛选阳性克隆与克隆化,筛选阳性克隆：常用方法有ELISA，放免，荧光免疫等，经过筛选可得到所需要的产单抗的细胞株。,阳性细

7、胞的克隆化：指筛选得到的阳性细胞通过无性繁殖而得到细胞集团的培养过程。一般经过3次克隆，可得到纯阳性克隆。克隆化常用方法为有限稀释法和软琼脂法。,有限稀释法：通过有限稀释，使每孔中理论上只有一个细胞，通过饲养细胞的帮助成长为克隆。第一次应使用HT培养基，其后用正常培养基即可。,软琼脂法：培养基中加入0.5%琼脂，将克隆打碎后再继续培养。,四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定,杂交瘤细胞的鉴定：主要是染色体分析。正常鼠脾细胞染色体数为40，全部是端着丝粒染色体；小鼠骨髓瘤的染色体数变异大，多为非整倍性，并且有中部着丝点染色体和亚中部着丝点染色体。杂交瘤细胞的染色体在数目上接近两种亲本细胞染色体数目的总

8、和，在结构上多数为端着丝粒。,染色体数目多而集中的杂交瘤细胞能稳定分泌高效价的抗体，而染色体数目少且分散的杂交瘤细胞分泌抗体的能力较低。,其他鉴定：Ig类和亚类的鉴定；亲和力鉴定；单克隆抗体的特异性、纯度和识别抗原的相对分子量等进行鉴定,五、单克隆抗体的大量制备,体外培养法：（1）传统培养方法：RPMI1640培养液，1020%小牛或胎牛血清，但由于杂蛋白太多，纯化困难。如采用无血清培养基（白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺），但产量低。一般来说，可获得10 ug/ml的抗体。（2）悬浮培养方法：悬浮培养或用DEAE-Sephadex A 50作为载体进行微载体悬浮培养。,动物体内诱生法：在接种

9、细胞前12周，注入降植烷（或液体石蜡)0.5ml破坏腹腔内膜，接种1x106瘤细胞，生成腹水后抽取几次可达10ml。优点是抗体效价高，量多，但也存在纯化困难的问题。,六、单克隆抗体的纯化,（1）澄清和沉淀处理：,腹水离心,收集上清夜,微孔滤膜过滤,去除细胞等杂质,去除细菌、支原体等,收集滤液,50%饱和度的硫酸铵沉淀,90%以上的单抗可被回收,（2）分离,1）凝胶过滤：用于IgG,IgM类抗体的纯化。常用Sephadex G 200作分离介质，可收集3个峰，最高峰为IgM，另2个峰为IgG，抗体回收率5080%，纯度95%以上。,2）阴离子交换层析：用于IgG类单抗的纯化。例如：pH7.4，I

10、gG1和IgG2能结合DEAE，随离子强度逐渐升高，依次洗脱IgG2a、2b以IgG3。,3）亲和层析：用蛋白A亲和纯化IgG类单抗。pH8.0,单抗结合；pH3.5,洗脱IgG2b；pH4.0,洗脱IgG3；pH4.5,洗脱IgG2a；pH6.0,洗脱IgG1,抗细胞表面分子的单抗：抗CD3 McAb：主要通过细胞清除、功能性受体封阻、免疫调变、刺激抑制细胞增殖等途径杀伤成熟T细胞或阻断机体细胞免疫反应达到抗排斥目的。1986年美国FDA已批准应用小鼠抗CD3 McAb治疗急性肾移植排斥反应。CD3McAb治疗心、肝移植排斥反应已完成期临床试验，正申请投放市场。,抗CD4 McAb：具有干扰

11、发育中的T细胞、阻碍CD4分子识别、清除CD4+T细胞、抑制T细胞活化以及抑制对靶细胞的杀伤等作用。可作为免疫抑制剂用于同种异体器官移植排斥反应的治疗、免疫耐受的诱导以及自身免疫性疾病的治疗等。治疗HIV感染，I期临床试验。1991年美国风湿病学年会上报道了用抗CD4McAb治疗类风湿性关节炎（RA）。抗CD4嵌合抗体（Centocor公司）治疗类风湿性关节炎、多发性硬化症也已进入期临床验证。抗CD4McAb（OrthoBiotech公司）预防器官移植排斥反应已开始临床验。,抗细胞因子的单抗：抗IL1、TNF McAb：抗炎抗体导向药物治疗：放射免疫疗法抗体导向化学疗法：甲氨蝶呤、长春新碱、阿

12、霉素免疫毒素疗法：蓖麻毒素、白喉毒素,第三节 鼠源性单克隆抗体的改造,抗体改造的目的：（1）降低免疫原性；（2）降低分子量,鼠源性单抗存在的问题：分子量大，穿透力低；抗原性强，易降低药效及引起副作用。,抗体改造的原则：保持抗体与抗原特异性结合的能力,抗体基本结构(一)重链（heavy chain，H）2条 轻链（light chain，L）2条(二)可变区（variable region,V区）恒定区（constant region,C区）(三)超变区（hyper-variable region,HVR),又称 互补决定区(complementary determining region,CD

13、R）骨架区（framework region,FR）(四)铰链区（hinge region）,一、人-鼠嵌合抗体,提取瘤细胞的mRNA,cDNA,逆转录,VH,VL基因,特异性引物,PCR,形成人-鼠嵌合的V-C区基因质粒,上游启动子、前导肽序列、下游剪切供体信号、增强子,克隆到人抗体的轻、重链C区基因的真核表达载体,转染骨髓瘤细胞,脂质体介导,筛选,阳性细胞,培养、表达,人-鼠嵌合抗体,二、改形抗体,Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补性决定区（CDR区），不是整个可变区。H链和L链各有三个CDR，其余为框架区。,改形抗体：用鼠源性单抗的CDR序列替换人Ig分子中的CD

14、R序列，可使人Ig分子具有鼠源性单抗的抗原结合特异性，又因抗体中鼠源部分比例少而基本消除了免疫原性，又称CDR移植抗体。,改形抗体问题：抗体亲和力下降，甚至丧失活性，原因是人Ig分子的框架区中的一些氨基酸与鼠Ig的CDR区不协调。,解决方案一：将鼠与亲和性有关的残基引入人Ig的框架区中，可显著提高抗体的亲和力。,解决方案二：选择与鼠源性单抗同源性最大的人Ig分子为框架区序列，再将人Ig中较为独特的残基替换成鼠CDR区附近的框架区残基。,模板替换：用与鼠对应部分有较大同源性的人框架区替换鼠框架区。表面重塑：对鼠CDR及框架区表面残基进行镶嵌或重塑使其类似于人抗体CDR轮廓或人框架区。补偿变换：在

15、人的框架区选择与CDR有相互作用，与抗体的亲和力有密切关系或对框架区空间结构折叠起关键作用的残基进行改变，以补偿完全的CDR移植。定位保留：在人源化的改形抗体中保留了鼠源性抗体可变区中参与抗原结合的氨基酸残基，包括CDR区和框架区中的一些关键残基。,三、小分子抗体,人-鼠嵌合抗体虽然能部分解决鼠源性单抗抗原性问题，但不能解决抗体分子量大，不易穿透组织的缺点。,基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单抗的V区（即保留了CDR区），而Ig分子的C区不表达，因此其分子量仅为原抗体的1/801/3。,小分子抗体（1）Fab片断抗体：包含有重链的VH+CH1以及完整的轻链。（2）FV抗体：由VH和VL组成。（3

16、）单链抗体：由抗体VH和VL通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，具有分子量小、穿透力强、免疫原性小的特点，且易与效应分子相连接，构建多种新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异性抗体的理想元件。（4）单域抗体：由VH或VL单个可变区组成，只有抗体分子的1/12，表面疏水性强，与抗原特异性结合的能力弱。（5）最小识别单位：由单个CDR区构成的小分子抗体，具有与抗原结合的能力，但亲和力低，也称超变区多肽。,单链抗体的优点：（1）可去除许多造成非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显像的背景更清晰。（2）更容易渗透到肿瘤组织中，增加有效药物的浓度。（3）分子量小，抗原性小，能消除人抗鼠的排异反应，从而延长

17、在人体内的半衰期。,单链抗体的构建方法一：杂交瘤细胞提取mRNA 反转录 cDNA PCR扩增 VH和VL基因 合成接头 用接头将VL的C端和VH的N端或VH的C端与VL的N端连接 单链抗体,单链抗体,接头：又称linker，必须能使重、轻链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型，并尽可能减少蛋白酶攻击和防止单链聚集。Linker长度为1425个氨基酸为宜，目前最常用的为15肽序列（Gly4Ser）3。,方法二：噬菌体表面呈现技术，可用于单链抗体的构建。,单链抗体可在大肠杆菌中表达，有3种表达方式（1）直接在细胞质中表达（2）与其他菌体蛋白融合表达成融合蛋白（3）分泌表达具有功能的单链抗

18、体：将单链抗体基因与引导分泌的信号肽基因相连接，使表达产物分泌出来，获得有活性的可溶性表达产物。,四、双功能抗体,（1）化学交联法：用化学试剂交联Ig分子表面的巯基。,（2）生物学方法：将分泌单抗的杂交瘤细胞与分泌另一种抗体的脾细胞融合，形成可分泌两种亲代抗体和杂种抗体的杂种-杂交瘤细胞。,（3）基因工程法：用接头连接不同抗体的VH和VL区，使它们不能形成链内的分子内配对，让其形成原抗体的分子内配对，构建双特异性抗体（SCFV)2。,双功能抗体的优点：避免了化学交联对抗体的损害，又可定向结合抗原部位，减少非特异性分布和副作用。,双功能抗体抗肿瘤：双功能抗体的一个臂识别肿瘤相关抗原，另一个臂识别

19、免疫效应细胞及分子，如CD3、毒素、药物等，介导T淋巴细胞、LAK细胞或毒素与药物发挥细胞毒作用。,CD3分子的主要功能是参与TCR/CD3复合体的装配和稳定以及信号转导,NK细胞或T细胞体外培养时，在高剂量IL-2等细胞因子诱导下成为能够杀伤NK不敏感肿瘤细胞的杀伤细胞，称为淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cells,LAK）。,五、抗体融合蛋白,（1）配基-配基型融合蛋白，如CD4-Fc,（2）配基-Ig型嵌合蛋白，如IL-2-Ig，应用较为成熟。,（3）配基-FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3,（4）受体-FV型融合蛋白,（5）酶-抗体型

20、融合蛋白：即为抗体酶，当抗体酶和肿瘤结合后，给与前体药物，在酶的转化下成为有效药物，可提高组织内药物浓度，提高药效，降低毒副作用。,抗体融合蛋白的构建：将第一个蛋白的终止密码子去除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因的共表达。,抗体融合蛋白也需用到linker，一般35个氨基酸即可，如加入一段疏水性和一定伸展性的较长肽段，可较好缓解两种蛋白的相互干扰。,抗体融合蛋白，可用原核或真核细胞表达。,原核表达：（1）分泌至菌体外表达，成为有活性的可溶性融合蛋白；（2）包含体形式表达，需溶解后重新折叠成有活性的蛋白质。,真核表达：能正确折叠和糖基化，但产量低。,融合蛋白的纯化，采用常

21、规离子交换或亲和层析的方法。,第四节 基因工程抗体和抗体工程,抗体发展的三个阶段：,（1）1890年Behring发现白喉抗毒素为代表，特点是用抗原免疫动物可获得多克隆抗体。,（2）1975年Kohler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表。,（3）1994年Winter以基因工程及噬菌体表面呈现技术制备噬菌体抗体库，从而制备基因工程抗体。,一、噬菌体抗体库技术的基本方法,1、获取目的基因：提取mRNA反转录获得抗体某一特定基因区段。抗体基因的组合多为单链抗体，也有用linker组合成功能分子。,2、抗体库技术的载体：常用噬粒，具有噬菌体和质粒的共同特点。抗体蛋白和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式

22、表达于噬菌体的表面，感染大肠杆菌，使目的克隆得以扩增。,构建噬菌体抗体载体时，在抗体基因与g基因之间引入了一个琥珀终止密码子，抗体基因的重组子若转化含有琥珀抑制基因XLBlue的宿主菌，抗体基因和g基因成为一个开放阅读框架，这时抗体就能借助噬菌体外壳蛋白而呈现在噬菌体表面。,如将重组子转化不带有琥珀抑制基因的宿主菌，由于抗体基因与g基因之间的终止密码子抑制了g基因的表达，便产生可溶性的Fab抗体。,3.淘筛：吸附洗脱扩增,再次感染大肠杆菌，使特异的噬菌体抗体淘筛。,噬菌体吸附靶抗原。,反复洗涤去除非特异性结合。,洗脱并收集与抗原结合的噬菌体。,4.表达与鉴定,目的克隆经过鉴定后，导入感受态菌株

23、，其产物用western blot检测。,二、噬菌体抗体库技术的特点,1、模拟天然全套抗体库：建库的外源基因为人体多克隆细胞的总mRNA；使用的通用引物来自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和VL随机重组也增加了抗体的多样性。,2、避开了人工免疫和杂交瘤技术,3、可获得高亲和力的人源化抗体：在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程。,三、基因工程抗体的表达,1、原核表达,2、真核细胞表达,3、转基因植物表达,4、转基因动物表达,第五节 抗体诊断试剂,一、血清学鉴定用的抗体类试剂,（1）沙门氏菌属诊断血清,（2）志贺氏菌属诊断血清,（3）病原性大肠杆菌诊

24、断血清,诊断血清的制备：制备抗原 O抗原，H抗原 免疫动物 采血 测定效价 抗血清 防腐剂包装,诊断血清的使用：玻片上做凝集反应。,HBsAg的诊断血清：反向被动血凝试验,红细胞甲醛处理 吸附抗HBs抗体 抗原+抗体 红细胞凝集,怀孕诊断试剂：妊娠试验是利用孕妇尿液及血清中含有HCG的免疫学特点，检测体内有无HCG的方法。目前临床上应用广泛的早早孕诊断试纸，也称单克隆抗体早孕检测，其原理是应用胶体金标记抗体，加入金标记后，直接在试纸上显示为红色，方便快捷。,抗ABO血型系统血清：根据红细胞膜上的A、B凝集原和血清内抗A、抗B凝集素的不同，将红细胞血型分为O、A、B、AB四型。,二、免疫标记技术

25、用抗体,1、荧光抗体诊断试剂：用荧光色素，如FITC（黄绿色荧光）、罗丹明（亮橙红色荧光）等标记抗体，即为荧光抗体。,（1）荧光抗体制备：,抗体的准备：加入生理盐水及碳酸盐缓冲液（缓冲液容量为总量的1/10），使最后蛋白浓度为20mg/ml，置冰槽中电磁搅拌510min。准备荧光素：每毫克蛋白加0.01mg 荧光素。结合（标记）：边搅拌边将荧光色素渐渐加入球蛋白溶液并继续搅拌1218h。结合期间应保持蛋白溶液于4左右。透析：结合完毕后，将球蛋白的溶液离心（2500r/min）20min，除去沉淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（04）过夜。过柱：取透析过夜的标记物过G-

26、25或G-50柱，分离游离荧光素，以PBS洗脱，收集标记的荧光抗体进行鉴定。,（2）荧光抗体质量鉴定：F/P比值的测定。F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求F/P的克分子比值为12。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，降低敏感性。,（3）免疫荧光测定方法：直接法和间接法。,激光共聚焦显微镜检测,鉴定食管癌细胞表达MMP-2，胞浆中绿色荧光为MMP-2，细胞核红色荧光为PI复染。,流式细胞仪检测：待测标本制备成单细胞悬液通过荧光染色后进入充满鞘液的流动室，鞘液压力与样品流压力是不同的，当二者的压力差异达到一定程度时，鞘液裹挟着样品流中细胞排成单列

27、逐个经过激光聚焦区。如果我们将细胞中感兴趣的部分特异性的标上荧光染料，那麽这些染料将在细胞通过激光检测区时受激光发出特定波长的荧光,通过一定波长选择通透性的滤色片,我们可将不同波长的散射光、荧光信号区分开来，并送到不同的光电倍增管中，经过一系列的信号转换、放大，数字化处理，我们就可以在计算机直观的统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光染料，我们可以利用FC同时测定一个细胞上的多种不同特征；如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还可以利用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究。,2、免疫组化抗体诊断试剂,（1）酶标抗体：用酶标记抗体，常用酶为辣根过氧化物酶(H

28、RP)，底物为二氨基联苯胺（DAB），两者作用后生成棕褐色沉淀物。,（2）酶标抗体的制备：1）原理：HRP经NaIO氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。,2）步骤：称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配的0.1M NaIO溶液，室温下避光搅拌20分钟；将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4过夜，再加20l 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的PH升高到9.09.5；立即加入10mg IgG(抗体，或SPA 5mg)在1ml 0.01M 碳酸盐缓冲液中，室

29、温避光轻轻搅拌2小时；加0.1ml新配的4mgml NaBH液，混匀，再置42小时，最后将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4过夜。,肿瘤组织免疫组化图片,3、ELISA法抗体诊断试剂,ELISA法原理：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。,HBsAg酶标诊断试剂HBeAg酶标诊断试剂HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）酶标诊断试剂测定HIV抗原的酶标抗体试剂甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊断试剂：诊断原发性肝癌癌胚抗原（CEA）的酶标抗体试剂：诊断消化道恶性肿瘤,改进

30、的酶标抗体：抗体+生物素+酶标的抗生物素，该系统可起放大作用，灵敏度更高。,4、放射免疫用抗体诊断试剂,氯胺T是对甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的钠盐，在水溶液中逐渐分解形成次氯酸，是一种氧化剂。在偏碱溶液中（pH7.5），氯胺T将125I的I氧化为I+，I+取代蛋白质酪氨酸苯环的氢，形成二碘酪氨酸。,放免测定原理：当标记抗原、非标记抗原和特异性抗体三者同时存在于一个反应系统时，由于标记抗原和非标记抗原对特异性抗体具有相同的结合力，因此两者相互竞争结合特异性抗体。由于标记抗原与特异性抗体的量是固定的，故标记抗原抗体复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变。非标记抗原量增加，相应地结合较多的抗体，从

31、而抑制标记抗原对抗体的结合，使标记抗原抗体复合物相应减少，游离的标记抗原相应增加，亦即抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比。,竞争法放免测定原理,三、导向诊断药物,放射免疫显像（radioimmunoimaging,RII）是将针对肿瘤相关抗原的特异性抗体用放射性核素标记后注入人体，随血液流达肿瘤组织，与肿瘤的相关抗原结合，从而使肿瘤组织局部放射性浓聚超过正常组织，然后用体外显像技术获得肿瘤的阳性显像图。,1、放射免疫显像的优点：（1）在体内定位肿瘤准确度高（2）在体内可检出0.5cm大小的病灶，并可检测肺、脑等部位的转移灶（3）小分子抗体容易到达肿瘤部位（4）抗体在肿瘤部

32、位，可保留69日（5）能观察抗体在血中的半衰期和可能出现的不良反应,裸鼠乳腺癌组织CEA 染色阳性(免疫组化400),注射131 I 标记的2CEA 单抗,第六节 抗体治疗药物,抗体为载体的导向治疗药物包括：放射性核素标记的抗体治疗药物抗癌药物偶联的抗体药物毒素偶联的抗体药物,毒素偶联的抗体药物,免疫毒素：毒素和抗体的交联物，现在常用的免疫毒素为重组免疫毒素。,毒素的来源：白喉毒素（diphtheria toxin,DT）绿脓杆菌外毒素（PE）产气夹膜杆菌磷脂酶（PLC）蓖麻毒素（ricin toxin,RT）等。,白喉毒素（DT）：65KD蛋白质，由白喉杆菌溶源性噬菌体编码，由A，B两条链组

33、成，A链起催化作用，B链辅助进入细胞。当毒素与宿主细胞结合而被吞入细胞的内泡中后，通过B亚单位转位区的介导，使A亚单位释放到宿主胞质内。A亚单位有毒性，可催化EFT2中的特殊氨基酸与NAD作用，使细胞内延伸因子2(EF-2)灭活，影响蛋白质的合成。白喉毒素有剧毒，估计1个毒素分子能使1个细胞内所有的EF-2灭活，故1-2个毒素分子进入细胞即可将细胞杀死。成人与鼠对白喉毒素尚有一定的耐受性。但肿瘤组织对白喉毒素高度敏感。故有人提出将肿瘤单克隆抗体与毒素A亚单位结合，注入患者。可使A亚单位对肿瘤有特异性杀伤作用，以此作为生物导弹来治疗肿瘤。,蓖麻蛋白（植物毒素）蓖麻蛋白的结构：A链毒性链，B链结合

34、链，二条链以二硫键相连。作用机制：B链附着于细胞膜，经二硫键还原，A链释出进入细胞与大亚基结合，利用其糖苷酶活性水解RNA的糖苷键而使核糖体失活，间接抑制EFT2的作用。,绿脓杆菌外毒素：包括3个区，N1区具有结合功能，N2区具有转位功能，C3区具有和DT的A链相同的功能，阻碍蛋白质的合成。重组人促黄体激素释放激素-绿脓杆菌外毒素 A融合蛋白，为我国研制的新型基因工程抗癌药物。,PLC：由产气荚膜杆菌分泌的毒素，能水解细胞膜上的磷脂酰胆碱而杀死细胞。,载体：将毒素携带至靶细胞表面，并与其结合，使毒素进入细胞内起作用。,载体具有的特性：分子量小，识别与结合靶细胞能力强，特异性好。,常用载体：（1

35、）小分子抗体FV或SCFV（2）细胞生长因子（3）激素（4）CD4：可识别HIV表达的gp120,免疫毒素的制备：克隆出毒素基因，去除毒素中非特异性细胞结合部位的基因。改造后的毒素与载体基因的cDNA 重组，并转入受体细胞中表达，形成融合蛋白，纯化后可得重组免疫毒素。,重组注意事项：（1）PE相关基因融合，载体基因需位于毒素基因的5端，否则无杀伤活性或活性很低。（2）DT及PLC的基因融合，载体基因需在毒素基因的3端。,VL：红色；VH：橙色；ETA：N2亮蓝，N1绿色，C3紫色；Linker：绿色；组氨酸标签：黄色,重组的抗肿瘤免疫毒素：人源化的上皮细胞黏附分子单链抗体绿脓杆菌外毒素,免疫毒素可用于治疗肿瘤、自身免疫病，并能克服组织移植排斥反应。,Anti-CEA免疫毒素抗肿瘤,