《微生物转化》PPT课件.ppt
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1、第二十五章 药物生物转化,张驰 副教授,第一节 微生物转化反应概述,生物转化,是指外来化合物在体内,细胞或酶的作用经过一系列化学变化形成其衍生物或分解产物的过程,也成为代谢转化。,生物转化常利用生长中的菌体,休止的菌体,酶,固定化酶以及固定化菌体作为母体进行药物的转化。主要的优点有反应的区域专一性和立体专一性。,早在2500年前的春秋战国时期,人们就已经知道制酱和醋。在宋代,采用老的曲子进行接种酿酒。不过当时人们并没有认识到可以利用微生物来合成化学物质。1864年巴斯德利用乙酸杆菌将乙醇氧化为乙酸。工业化的里程碑是50年代美国普强药厂利用微生物黑根霉的羟化酶将黄体酮转化为11-羟基黄体酮,即对
2、甾体化合物的结构改造。固定化细胞,基因重组等技术的发展,能将几种不同合成基因构建到同一个工程菌中使得一次培养同时进行几步转化反应,使微生物转化在天然药物修饰中发挥更重要的作用。,微生物转化的发展,第一阶段:菌体生长阶段,在该阶段中主要是供给菌体丰富的营养,使其充分繁殖发育。(温度,pH,通气条件,培养及成分。)第二阶段:微生物转化阶段,一般在生长阶段结束时加入底物溶液,有些还需加入诱导剂。,微生物转化的不同阶段,分批培养转化法利用酶进行生物转化应用渗透细胞进行生物转化应用孢子进行生物转化应用固定化细胞进行生物转化应用干燥细胞进行生物转化静息细胞转化法,常用的转化方法,微生物转化实验概要过程如下
3、:选择需要的菌株 培养成熟菌丝或孢子 选择合适的转化方式 转化培养或转化菌丝及孢子悬浮液转化 转化液的分离提取 产品纯化,微生物转化的过程,由有活性中心都和特殊空间结构的酶作为催化剂;酶催化作用的速度极快;在常温常压和中性条件下进行高效转化反应,简化设备,降低成本;生物转化的专一性,故底物不要求很纯(Ex.粗淀粉)转化过程容易调节(简单的用酸,碱,温度,离子调节)转化过程产生杂质少,过程无毒,无臭,无味,可用于食品,医疗。把含酶细胞或酶本身固定在载体上,可使转化过程连续化。酶来源广泛。可以实现化学反应无法做到的转化。,微生物转化的特点,第二节 生物转化反应类型,最为常见的生物转化反应,在甾体药
4、物合成上应用较多。环氧化反应是生物转化中的一个重要类型,C=C经氧化可形成环氧化合物,可生产磷霉素。,氧化反应,许多醛类,无论式脂肪族,还是芳香族,饱和或不饱和,羟基或卤素取代都能被微生物还原成醇。,还原反应,麻黄碱:利用微生物将苯甲醛和乙醛缩合成1-苯基-1-羟基丙酮,再与甲胺缩合,用活性铅还原,得麻黄碱。,缩合反应,可的松脱氢后苯环形成双键,具有较高的抗炎活性。,脱氢反应,该法是降解甾体物质侧链的重要反应。采用链霉菌转化阿魏酸制备香草醛为例。,碳链氧化降解,第三节 微生物转化在药物中应用,甾体指的是固醇或皮质类激素,由于这类激素都含有相同的结构,所以统称 为甾体类激素。甾体在临床上应用十分
5、广泛,解热镇痛,消炎杀菌等。,甾体微生物转化,1950年Kendall,Reichstein与Hench因发现类固醇的消炎作用而获得诺贝尔奖。1952年以化学方法以牛胆汁中的脱氧胆酸为原料合成肾上皮质激素,反应共需31个步骤,产品售价每克$200;1952年利用Peterson利用黑根霉产生的羟化酶将反应过程缩短为3个步骤,产品售价每克$6;1980年使用突变的分支杆菌分解植物油中的固醇以作为原料,产品价格每克$0.46。,甾体合成技术的演进,羟化反应环氧化反应脱氢反应A环芳构化还原反应水解反应,甾体生物转化的类型,羟化反应,孕酮,皮质激素,环氧化反应,A环芳构化,脱氢,甾体生物转化的原理和方
6、法,甾体生物转化的原理不同于氨基酸,抗生素,蛋白质等的发酵。而是利用微生物中特殊的酶对甾体的某一部位进行特定的化学反应获得的产物。在这一过程中为获得较多的转化酶,我们需要确保菌体产酶的最佳条件,诱导所需要的酶,抑制不需要的酶。,在菌体生长期结束后加入甾体底物,由于其不溶于但能溶于可与水按一定比例混溶的有机溶剂,再加入培养液中转化。,根据转化时微生物的状态可分为4种转化方式:生长培养方式:在微生物培养的中后期加入底物,一边培养,一遍转化。静态菌体悬浮方式:菌体充分生长后,离心得到的菌体悬浮在水或适当 的缓冲液中,再加入甾体进行转化。混合培养方式:以A出发转化成B,需要两种以上的酶参与,单独转化费
7、 时费力,所以常采用混合培养的方法,可以一步得到B 省略了中间过滤步骤。固定化方式:一次制成的菌液反复用于转化是可行的,为了避免溶菌,需要将其固定在水不溶载体上进行转化。,影响甾体生物转化的因素,物理因素搅拌:增加搅拌速度,可以增加溶氧使基质均匀,提高转化率。通气:增加氧的溶解,促进菌体生长及生物转化。培养基的组成碳源:常用的有葡萄糖,蔗糖,麦芽糖,糊精。氮源:(有机,无机金属离子:增加对转化有益的离子,去除负向影响的离子。,产物的分析与分离方法,纯化 需要用适当的与水不溶的有机溶剂将甾体从转化液种提取出来。常用的有氯仿,乙酸乙酯,二氯甲烷等。溶剂的用量需根据产物在转化液于提取液中的分配系数而
8、定。提取时防止乳化。浓缩后利用各种色谱法得到较纯的甾体转化物。分析 转化过程中需要实时监测残余底物及生成产物的量及比例,以确定转化终点。常用紫外分光光度法,HPLC等。,第四节 新技术在微生物转化的中应用,随着现代生物科学和生物技术的迅速发展,以及一些分析测试技术的应用,微生物转化也得到了进一步的发展。基因工程技术、固定化细胞转化技术、双水相转化技术、超声波技术、有机介质微生物转化以及生物反应器等综合应用于微生物转化反应体系,不仅可使转化的效率成倍增长,而且还有可能使整个反应过程连续、自动化。同时,一些分析测试技术如核磁共振、质谱等已经应用于微生物转化的在线检测。,一、基因工程技术在微生物转化
9、中的应用,随着近年来分子生物学的发展,人们对基因工程的认识也逐步加深,这为微生物转化提供了新的思路。基因工程技术的发展和实用化为此开辟了有效途径。只要生物细胞中存在有催化某一生化反应的酶,即使其量微不足道,应用基因重组技术,通过基因扩增与增强表达,人们就可能建立高效表达特定酶制剂的基因工程菌或基因工程细胞,从而进一步构建成新一代的催化剂固定化工程菌或固定化工程细胞。,如,应用DNA重组技术建立了丝氨酸和色氨酸合成酶工程菌,这种工程菌组装的生物反应器可以用甘氨酸和甲醛为原料制造丝氨酸,反应液含丝氨酸超过400gL,再从丝氨酸与吲哚转化生成色氨酸,反应液中色氨酸浓度达到200gL。此外利用基因工程
10、还可以将能进行生物转化的相关酶从微生物、植物甚至动物细胞中克隆出来再导入一个微生物中进行表达,从而产生能对底物进行转化的一系列酶,将原来复杂的几种转化过程缩短为一个转化反应。目前在这方面的研究也是微生物转化的一个趋势,并且具有广阔前景。,二、固定化细胞转化技术在微生物转化中的应用,固定化细胞转化技术自20世纪70年代问世以来已经广泛应用于工业、农业、医学、环境保护、能源开发以及理论研究等方面,并取得了丰硕成果。利用固定化细胞转化技术,省去了破碎细胞提取胞内酶的过程,完整细胞得到固定后,酶活损失较少,活性回收率高,并且保持了细胞内原有的多酶体系,对于一些需要多步催化的反应过程,一步即可完成。被固
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