《微生物育种》PPT课件.ppt

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1、第三章：微生物育种,微生物育种，无论从自然变异选择还是人工诱变的选择，都是建立在遗传和变异的基础上的。,工业微生物育种技术的发展，大致经历了如下阶段：自然选育 微生物纯种培养法发明之后，开始了微生物纯种的自然选育。如当时的酒精发酵，纯系良种的推广，扭转了酒精生产不稳定的现象。这是最早应用微生物遗传学原理于微生物育种实践的一个实例。诱变育种 40年代初，Beadle和Tatum“一个基因一种酶”学说的提出，意味着遗传学从细胞水平发展到分子水平，促进了工业微生物育种技术的发展。如抗生素工业的兴起。代谢控制育种 以50年代末Glu发酵成功为标志，其优势在于以诱变育种为基础，打破了微生物调节机制这一天

2、然屏障，获得各种解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地积累有用产物。代谢控制育种 的兴起意味着诱变育种发展到理性阶段，导致了氨基酸、核苷酸及某些次生代谢产物的高产菌株大批投入生产。,诱变育种是发酵工业育种的重要手段和技术，目前几乎所有工业生产菌种都经过诱变处理。,1、遗传性状稳定2、纯净无污染3、繁殖力强、生长速度快、短时间内能产生所需产物4、能诱变产生遗传性变异5、产量高、收得率高,从自然界分离的野生菌株，在产量或质量上均难适合工业化生产的要求。理想的工业生产菌种必须具备：,微生物育种的途径：诱变、杂交、基因工程,诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传结构和功能，从

3、中筛选出产量高、性状优良的突变株，并设计出适合该突变株最佳的培养基和条件，使其在最适的工艺条件下最有效地合成产物。,诱变育种有以下几个优点：速度快，收效大、方法简单。,第一节 诱变育种,分三个阶段：菌种基因型改变，突变体筛选，产量评估,诱变育种的三大要素：诱变剂、诱变条件、筛选技术。,出发菌株的选择与纯化单孢子（单细胞）悬液的制备诱变剂及诱变剂量的选择诱变处理方法高产菌株的分离,诱变育种的步骤,对出发菌株的要求：(1)从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高；(2)在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在生产过程中经过自然选育的菌株；(3)采

4、用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株；,一、出发菌株,(4)有些菌株在发生某一变异后会提高对其他诱变因素的敏感性，故有时可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。例如，在金霉素生产菌株中，曾发现以分泌黄色色素的菌株作出发菌株时，只会使产量下降，而以失去色素的变异菌株作出发菌株时，则产量会不断提高；(5)采用一类被称为“增变菌株”的变异菌株，它们对诱变剂的敏感性比原始菌株大为提高，更适宜作为出发菌株；(6)在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考虑能累积少量所需产物或其前体的菌株;而在选择产抗生素的出发菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有一定程度提

5、高的菌株作为出发菌株。,连续诱变育种过程中如何选择出发菌株突变株的产量是数量遗传，只能逐步累加，一次性大幅度提高发酵水平不太容易。在选择出发菌株时，应挑选每代诱变处理后均有一些表型上改变的菌株，如发酵单位有一定程度的提高、形态上发生过一次变异或产生过回复突变的菌株等，以利于突变率的增加。,几乎每代出发菌株分别在发酵单位、菌落大小、菌落结构或颜色、基质菌丝颜色、可溶性色素以及生长速度等表型发生过变异，继续经诱变处理，产量又有显著的提高。,表：灰黄霉素高产菌D-756诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系,头孢菌素C产生菌C-20诱变系谱菌株表型变异与产量递增关系,这些表型上改变了的菌株，说明已动摇

6、了遗传稳定性，继续处理，对诱变剂的敏感性就提高了，因而容易发生变异，易于达到育种目的,出发菌株的纯化纯种分离方法，常用划线分离法和稀释平板法。在诱变育种中，出发菌株的纯化虽然是辅助手段，但它是不可缺少的技术步骤，例如前面的例子中，灰黄霉素变种B-53，经自然分离，获得的变株C-04的产量比前者显著提高。,在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。这样一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，另一方面又可避免长出不纯菌落。菌悬液是直接供诱变处理的，由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或缓冲液制备而成，其质量将直接影响诱变效果。对菌悬液的制备有如下的要求：,二、单孢子（单细胞）悬液的

7、制备,供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮：供试细胞培养物要新鲜，细胞生理活性方面既要同步，又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性好。对细菌来说，常常通过前培养达到要求。,通常丝状菌菌株由于遗传分离产生不纯现象，一个多核细胞经诱变剂处理后，某个核发生有益的突变易被其他尚未突变的核竞争性地抑制，多核菌体会降低单位存活菌的突变率,制备菌悬液时，采取分散法，使细菌或孢子团块在培养液或悬浮液中充分分散，力求90%以上为单孢子。并务必除去菌丝片段，因为一般菌丝是多核的。菌悬液的浓度，要求霉菌孢子浓度约为106mL-1，放线菌孢子浓度约为106-107mL-1。菌悬液的孢子或细菌数可用平板计数、血球计数

8、器计数和光密度法测定。制备菌悬液通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制，以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。,1、诱变剂种类选择：不同微生物对同一种诱变剂敏感性有很大区别，这不仅有细胞透性的差异，也与诱变剂进入细胞后相互作用不一致有关（修复机制）。根据诱变剂作用机理，再结合菌种特性来选择诱变剂种类。例如，灰黄霉素野生菌使用氯化锂、紫外线效果好；头孢C产生菌比较有效的诱变剂是紫外线、氯化锂、甲基磺酸乙酯、博莱霉素；青霉素生产菌以亚硝基胍、氮芥、乙烯亚胺等烷化剂更为适合。对遗传稳定的出发菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂。对遗传不稳定的出发菌

9、株，采用温和诱变剂。对诱变史较长的高产菌株，如多次使用某一诱变剂，可能出现“钝化”现象，此时则需改用另外的诱变剂。,三、诱变剂及诱变剂量的选择,2、最佳剂量的选择：经长期诱变后的高产菌株、遗传性状不太稳定的菌株，宜用较温和的诱变剂和较低剂量处理。要筛选具有特殊性状的菌株、较大幅度提高产量的菌株，则用强诱变剂和高剂量处理。对野生低产菌株，开始用高剂量，然后逐步用低剂量处理。对多核细胞菌株，用高剂量处理。,诱变处理方式：单因子处理：是采用单一诱变剂处理（一般突变率低）复合因子处理：是指采用两种以上诱变因素处理（突变率高）分下列几种情况：1、两个以上因子同时处理2、不同诱变剂交替处理3、同一诱变剂连

10、续重复使用4、紫外线光复活交替处理 复合因子处理中，为了提高诱变效果，在具体使用时还要注意诱变剂处理先后和协同效应问题。,四、诱变处理方式,五、影响突变率的因素,菌种遗传特性菌体细胞壁结构培养条件和环境条件 诱变前预培养和诱变后培养（突变体的修复、表型迟延）温度、pH、氧气等外界条件的影响 平皿密度效应,微生物通过诱变处理后，群体中产生各种类型突变体，有正突变、负突变和未突变的菌株，需要经过分离和筛选，逐一挑选出来。随机突变，定向筛选。筛选的条件决定了选育的方向，设计一个好的筛选方案是诱变育种的重要前提。对抗性突变株或营养缺陷突变株，可用选择性培养基进行筛选，以利于突变株的生长。对产量突变株，

11、高产和负变菌株都能在同一培养条件下生长，所以难以分辨。需要做大量的、艰苦的工作，建立表型变异与产量的关系。,六、突变体的分离和筛选,出发菌株,诱变,绝大多数个体死亡,少数存活,少数突变,多数未变,多数负变,少数正变,少数变幅大,多数变幅小,少数宜投产,多数不宜投产,存活率 突变率正变率高产率 投产率,1.基本环节,第一代：出发菌株,分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）,挑选菌落 200个,初筛 1瓶/株,3-5株（提供第二代诱变出发菌株）,诱变,50株复筛,2.常规筛选程序,第一代：出发菌株,分离到平皿上,打琼脂块挑菌落1000-3000 块,挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大

12、的菌落,选3-5株（提供第二代诱变出发菌株）,诱变,初筛：1-2瓶/株,置于检定板上,选30-50个菌株,复筛,3.简便筛选程序,第二节 营养缺陷型菌株的筛选,营养缺陷型：野生菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，称为营养缺陷型。,营养缺陷型菌株的检出是通过一系列培养基来实现的。基本培养基（MM）：能维持野生型菌株正常生长的培养基。补充培养基（SM）：为了鉴别某种缺陷型菌株，在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子，称补充培养基。完全培养基（CM）：能满足各种缺陷型菌株生长的培养基。,营养缺陷型的诱变方法和

13、所用的诱变因子与普通诱变育种基本相同，只是由于营养缺陷型属于单一基因突变，各种诱变剂的功能不同，有的不宜作为营养缺陷型诱变剂。如：电离辐射易引起染色体巨大损伤。用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍，紫外线、亚硝酸等。其中亚硝基胍诱发频率极高，一般可达10以上。,一、营养缺陷型菌株的分离和筛选一般包括：诱发突变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型、鉴别缺陷种类等4个步骤。,（一）营养缺陷型的诱发,在诱变后的存活菌体中营养缺陷型菌株的数量很少，一般仅占存活菌体的百分之几或千分之几，而野生型细胞却大量存在，因而要采取一些措施，尽量淘汰野生型细胞，使缺陷型菌株得以富集，以利于检出。常用的方法有抗生素法和菌丝过

14、滤法,（二）淘汰野生型菌株,1.抗生素法 常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青霉素法，后者用制霉菌素法。,青霉素法的原理为：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细菌。,制霉菌素法原理：制霉菌素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型菌株的作用。,(1)将诱变处理后的菌体用完全培养液振荡培养2-3代以结束表型延迟现象，达到稳定的表型和生理状况。(2)将经完全培养基培养后的菌体进行离心、洗涤，转移

15、到基本培养中进行饥饿培养4-6h，以消耗从完全培养基中摄取并储存在体内的氮素营养，使其停止生长，防止被以后加入的青霉素杀死。(3)再转移到含无机氮的培养基中培养3-4h，使野生型细胞刚刚进入对数期，加入一定浓度的青霉素（革兰阴性菌约600-1000gmL，革兰阳性菌约 50gmL）,青霉素淘汰细菌野生型细菌的方法和步骤：,(4)经涂抹培养后，统计完全培养基和基本培养基平皿上菌落的差数，确定哪一种青霉素浓度的样品中含缺陷型数量最大，则可从该试样中进一步分离营养缺陷型。,由于青霉素的加入，致使大量野生型细胞壁瓦解、死亡，释放出细胞内的许多物质，其中有的被缺陷型菌株作为营养利用而生长繁殖，最终也被青

16、霉素破坏，造成缺陷型筛选率大为下降。为防止这一情况发生，可在基本培养基中加入 20蔗糖以提高渗透压。阻止细胞原生质体破裂外渗，使缺陷型菌株免遭杀伤。再把培养物移入到不含青霉素的低渗溶液中，稀释，涂皿分离。,2菌丝过滤法 真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养1Oh左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔3-4h过滤一次，重复3-4次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀释，涂皿分离。,3高温差别杀菌法 利用芽孢菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异

17、，让诱变后的细菌形成芽孢，然后把处在芽孢阶段的细菌转移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留，起到了浓缩作用。,1点植对照法 诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平板上进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上的孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，每皿约点接 3040点，同时培养，然后观察对比菌落生长情况。,(三)营养缺陷型的检出,诱变后的微生物群体，浓缩后野生型细胞和营养缺陷型细胞数量比例发生了很大变化，但终究还是个混合体

18、，要设法把缺陷型从群体中分离检出，有关方法介绍如下：,如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上，进一步复证。该法可靠性强，但工作量很大。,2.影印法 经富集后的孢子或菌体分离在完全培养基上培养至菌落成熟(称母皿)，用灭菌后的特制“丝绒印模”在母皿平板的菌落上轻轻一印，再转印到方位相同的另一基本培养基和完全培养基的平板上。培养后观察比较菌落生长情况。,采用影印法检出霉菌营养缺陷型时，要注意两点：第一，防止菌落扩散和蔓延，可以在培养基中加入0.5左右的脱氧胆酸钠，或在基本培养基中用山梨糖作为碳源，再加入适量蔗糖使

19、菌落长得小而紧密；第二，为了克服孢子扩散而带来不纯现象，在操作方法上可作如下改进：,当诱变后分离在完全培养基上的菌落尚未形成孢子之前，用一张灭菌的薄纸覆盖琼脂平板上，继续培养，待菌落的菌丝长到纸上后，把纸转移到基本培养基平板上。此时薄纸上的菌丝向基本培养基表面生长，便在相应位置上长出菌落。该法也有不足之处，薄纸易带有完全培养基成分，会把部分营养带到基本培养基中，易造成误差，故要进行几个平皿的重复试验。本法适用于细菌、酵母菌，其次对小型菌落的放线菌和霉菌也适用。,3夹层法 先在培养皿底部倒入一层基本培养基，凝固后，倒入含有菌体细胞的基本培养基，待凝固后，继续加第三层基本培养基。培养后平板上首先出

20、现的菌落，为野生型菌落。此时在平皿底部做好颜色标记。接着加上一层完全培养基，经培养，如果在基本培养基上不长而在完全培养基上生长的小型菌落，可能是营养缺陷型。,4.限量补充培养法 该法有两种情况，如果试验的目的仅是检出营养缺陷型菌株，则其方法是将富集培养后的细胞接种到含有0.01蛋白胨的基本培养基上，培养后，野生型细胞迅速地长成大菌落，在平皿底部作好颜色标记，而生长缓慢的小菌落可能是缺陷型，此称限量培养；,如果试验目的是要定向筛选某种特定的缺陷型，则可在基本培养基中加入某种单一的氨基酸、维生素或碱基等物质，称为补充培养。补充这些物质的数量可根据已有缺陷型进行测定后加以确定。,通过营养缺陷型检出，

21、仅仅了解突变体属于营养缺陷型菌株，只有通过鉴别测定，才能确定菌株属于哪一类营养缺陷型（如氨基酸、维生素类、碱基类）或更具体的是缺陷哪一种营养因子（缺哪种氨基酸或哪种维生素)。所以缺陷型菌株的鉴定，实际上就是测定营养缺陷菌株所需的生长因子种类。,(四)营养缺陷型的鉴定,1.鉴定方法营养缺陷型的鉴定方法可分成两大类：一种方法是在一个子皿中加入一种营养物质以测定多株缺陷型菌株(1050株)对该生长因子的需求情况。第二种方法是在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况，称为生长谱法。,2.营养缺陷型鉴定步骤：测定缺陷型菌株所需生长因子的类别 具体测缺陷该类别物质中的哪种生长因子 用单一生

22、长因子进行复证试验。,氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸类。酵母浸出液，其中氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶均具有。维生素混合物，代表维生素类。核酸碱基混合液或酵母核酸(0.1碱水解物)，代表嘌呤、嘧啶类。,通常分别用以下物质来代表氨基酸、维生素、核酸碱基：,(1)缺陷型类别的测定先选择缺陷型菌株所需用的类别代表物质：用于营养缺陷型测定的氨基酸有 21种。一般用L-型氨基酸，而DL-型氨基酸虽然也可以使用，但要增加1倍的浓度。D-型氨基酸由于微生物难以吸收利用，不能使用。用于鉴别缺陷型菌株的维生素约有15种。核酸碱基有7种，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶。,

23、要鉴定单缺氨基酸或维生素的营养缺陷型，较为简便的方法是分组测定法。把21种氨基酸，组合6组，每6种不同氨基酸归为一组。,(2)缺陷型所需生长因子的测定,组合生长因子,生长因子的配制方法：把同一组的氨基酸粉末混合置于洁净的瓶中，加入灭菌的蒸馏水，充分溶解，置冰箱保存。配制浓度：用于放线菌测定的氨基酸约1mgmL 用于霉菌测定的约10mgmL 维生素一般0.1mgmL 生物素、维生素B12约0.01mgmL测定方法：缺陷型菌株和基本培养基混合制成平板，把 6组生长因子直接点加于同一琼脂平板上，或用滤纸片沾取后覆于琼脂平板上，培养后，观察哪一组或哪两个组区产生混浊生长圈，即可确定该菌株缺陷的生长因子

24、。,1、生产上：微生物育种，协助解除代谢反馈调控机制，达到大量积累中间产物或某种终产物的目的 天冬氨酸-半醛 二氨基庚二酸 赖氨酸 高丝氨酸 甲硫氨酸 苏氨酸2、作为杂交育种、重组育种的遗传标记3、遗传学研究中，转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子研究中的标记。,二、营养缺陷型突变株的应用,黄色短杆菌的代谢过程,抑制,黄色短杆菌的代谢特点天冬氨酸激酶（AK），是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys、Thr的协同反馈抑制 协同反馈抑制：该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。,两个

25、分支点的优先合成机制：优先合成Hos，然后再优先合成Met 当Met过量时阻遏琥珀酰高丝氨酸合成酶，使代谢流向合成Thr的方向进行 当Thr过量时反馈抑制高丝氨酸脱氢酶，使代谢流向Lys的合成上。（MetThrLys）,育种途径 1.切断或减弱代谢支路 切断或减弱合成Met、Thr的分支途径选育营养缺陷型或渗漏突变株渗漏缺陷型:遗传障碍不完全的突变型，其中某一种酶的活性下降而不是完全丧失，所以这种缺陷型能少量合成某种代谢终产物，能在基本培养基上进行少量的生长。由于渗漏缺陷型不合成过量的终产物，所以不会造成反馈抑制而影响中间代谢产物的积累。,A、需要选用HomL（L，leakage）其意义在于实

26、现优先合成的转换：可引起一种终产物的过量生成。,高比活性的高丝氨酸脱氢酶（HD）使Met、Thr优先合成。若往培养基里添加过量的Met，将HD的活性控制在原来活性的1/3，在野生株中也能积累5g/L Lys，进一步通过突变将HD比活性降低到原来活性的1/3，可积累20g/L Lys。在这样低的比活性下，不添加Thr和Met，野生菌株也能正常生长。但如果单独过量添加一种Thr或Met，反而由于过剩的Thr或Met抑制或阻遏本来已经活力很低的HD使Thr或Met合成不足而抑制生长。,结果：由于HD活性下降但不完全丧失，使代谢流发生变化，使原来优先合成Hos方向转向合成Lys方向。而Thr和Met少

27、量合成，生成的Thr的量不足以与Lys共同对AK酶起协同反馈抑制，就使Lys得以积累。,B、需要选用Hom-，其意义在于：解除了Hom的优先合成机制，阻断了代谢向Met、Thr的方向进行，节省了原料，可以使Asp-半醛这个中间代谢产物全部转入Lys的生物合成上。,在培养基中限量的供给Met、Thr（或者Hom），对于AK酶活性的调节有着重要意义。因为AK酶是一个协同反馈抑制的变构酶，限制了其中某一个抑制物（Thr），则Lys的浓度再高，也不会影响到AK酶的活性，那么，代谢一直向着赖氨酸合成的方向进行，使得产物的合成畅通无阻。,双重营养缺陷型突变株（Met-+Thr-）,其本质和Hom-相同。优

28、点：遗传性质稳定，回复突变的几率少。,人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸,高丝氨酸脱氢酶,不能合成,可以大量积累,人工诱变的菌种不能产生,三、抗阻遏和抗反馈突变型,抗阻遏和抗反馈突变型都是由于代谢失调所造成的，它们都有共同的表型，即在细胞中已经有大量终产物时仍然持续合成该产物，但失调的原因不同。,抗阻遏突变型是由于调节基因发生突变或操纵基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不再能和代谢终产物结合或者结合以后不能作用于已突变的操纵基因，因此尽管有很多终产物存在，细胞内仍然合成有关的酶去合成这些终产物。抗反馈突变型则是变构酶基因发生变化，使变构酶不再能和代谢终产物结合，使合成代谢中的这一酶（一般是第一

29、个酶）仍具有催化活性，从而消除了反馈作用，使细胞能过量积累这一终产物。,抗阻遏和抗反馈突变型的选育,诱变处理后，选育结构类似物抗性突变株，这些突变株就包括了抗阻遏和抗反馈二种类型突变。结构类似物是指一些和细菌体内氨基酸、嘌呤、维生素等代谢产物结构相类似的物质。结构类似物抗性突变株，即是那些在含有类似物的环境中，其生长不被抑制的菌株，细菌照样合成终产物。,从理论上讲，选育Hom-进行赖氨酸发酵，如果在其培养基中限量供给Thr，则AK酶的活性不会受到Lys的反馈抑制，实际上Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用。因此，对于黄色短杆菌的Lys发酵，仅仅选育Hom-是不够的。为了高效率的转化Lys，需

30、要解决这一问题：使该酶（AK）脱敏（就是该酶具有抗反馈抑制或阻遏的能力），如何使其脱敏呢？,解除Hom-反馈调节（反馈阻抑）,选育结构类似物抗性突变株（X r）S-L-半胱氨酸抗性突变株 AEC r（效果最佳，应用最广）-甲基赖氨酸抗性突变株 ML r L-赖氨酸氧肟酸盐抗性突变株 LysHxr 苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株 ThrHxr,L-Lys:CH2(NH2)-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)COOHAEC:CH2(NH2)-CH2-S-CH2-CH(NH2)COOH结构类似物AEC的作用机制：起假反馈抑制作用 AEC 与L-Lys结构相似，被天冬氨酸激酶所误认，与Thr一起在天冬氨

31、酸激酶的变构部位上结合，协同抑制酶活。抗结构类似物突变株的实质：天冬氨酸激酶的结构基因发生突变。,第三节 体内基因重组育种,体内基因重组是指采用接合、转化、转导和原生质体融合等遗传学方法和技术使微生物细胞内发生基因重组，以增加优良性状的组合，或者导致多倍体的出现，从而获得优良菌株的一种育种方法。,原生质体融合 通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，称为原生质体融合或细胞融合。,原生质体融合的优点,重组频率较高。如放线菌原生质体融合频率达 10-210-1，小型丝状真菌达10-310-2，细菌和酵母也达10-610-5。受接合型或致育型的限制小。将原生质体进

32、行融合与细胞表面结构无关，二亲株中任何一株都可起受体与供体的作用，这有利于不同种属间微生物的杂交。遗传物质的传递更为完善。原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，既有质配又有核配，原核微生物可以有2个或多个完整的基因组携带到一起的机会，放线菌中还能形成短暂的或拟双倍体的融合物，在真菌中能形成暂时的或稳定的双倍体。重组体种类多有助于外源基因的转化,原生质体融合的一般原理,先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶(如细菌可用溶菌酶或青霉素处理，放线菌可用溶菌酶或相应的脱壁酶，真菌可用蜗牛酶或相应的脱壁酶等)去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促

33、融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子。,原生质体融合的主要过程,原生质体制备 G+细菌：细胞壁成分主要为肽聚糖，一般用溶菌酶进行细胞壁的消化，如枯草杆菌和巨大芽孢杆菌。乳酸链球菌的细胞壁必须兼用溶菌酶和细菌淀粉酶才能消化。黄色短杆菌的细胞壁不易被酶消化，可先用青霉素处理，再用溶菌酶进行消化。G-细菌：其细胞壁除肽聚糖外，尚含蛋白质、脂质、核聚糖等，单用溶菌酶不能完全脱壁。采用EDTA加溶菌酶，或甘氨酸-溶菌酶-EDTA。,包括原生质体制备、融合、再生

34、和融合子的选择等步骤。,链霉菌：一般将链霉菌接种到含甘氨酸（含量为0.83.5%）的培养基中，培养后所得的菌丝对溶菌酶较敏感。酵母：将菌株接种于含有0.2%巯基乙醇和0.06mol/L EDTA的溶液中，再用细胞壁溶解酶去壁。用蜗牛酶或纤维素酶处理酿酒酵母时，添加0.1%巯基乙醇可提高原生质体的形成率及形成速度。霉菌：其无性孢子是单细胞，生理状态较为一致，是制备原生质体的良好来源。制备各种霉菌原生质体所用的酶也各不相同，如米曲霉用蜗牛酶，产黄青霉用纤维素酶、玛瑙螺酶等。,原生质体融合和再生,制备好的二亲本原生质体可通过化学因子诱导或电场诱导进行融合。常使用的化学因子是PEG。其诱导融合的机制一

35、般认为有两方面：一是降低了原生质体的膜电位，然后原生质体通过Ca2+交联而促进凝集；一是由于PEG渗透压的脱水作用，扰乱了分散在原生质膜表面的蛋白质和脂质的排列。电融合技术是上世纪八十年代兴起的，融合过程首先是原生质体在电场中极化成偶极子，并沿电力线方向排列成串，然后，在加直流脉冲后，原生质体膜被击穿，从而导致融合发生。原生质体仅有 一层大约10nm的细胞膜，具生物活性，但不能在普通培养基上生长，必须涂布于再生培养基使其再生。再生培养基以高渗培养基为主。,融合子的选择,利用营养缺陷型利用灭活的原生质体 实验表明灭活亲株可以形成有生物活性的重组子。利用荧光染色 在双亲原生质体制备过程中，向酶解液

36、中加入荧光色素使其形成带有荧光色素的原生质体，离心清洗掉多余的染料，然后进行融合处理。融合子的确定主要依据：个体上同时观察到双亲染色的两种荧光色素，即可判断大融合子；个体上只表现双亲中一种染色的荧光素，即可认为是无融合的原生质体；个体上不发出荧光，这可能是原生质体失活所致。,一般认为，有两个遗传标记互补就可以确定为融合子。,第四节 基因工程育种,目的基因（即外源基因或供体基因）的取得载体系统的选择目的基因与载体重组体的构建重组载体导入受体细胞工程菌或工程细胞株的表达、检测以及实验室和一系列生产性试验等,基本操作包括：,基因工程的应用,在生产多肽类药物、疫苗中的应用改造传统工业发酵菌种动、植物特

37、性的基因工程改良基因工程在环境保护中的应用 如重组杀虫细菌、固氮菌等农业微生物菌株的应用，减少了环境污染。,本章思考题：,何谓诱变育种？试述诱变育种在发酵工业中的作用和地位2.在发酵工业生产中，理想的生产菌种应具备哪些性状？3.在诱变育种时，出发菌株如何选择？对菌悬液有何要求？4.针对不同微生物，如何选择诱变剂和诱变剂量？5.筛选产量突变株时，应考虑哪些基本环节？6.试述筛选产量突变株的简便程序。7.营养缺陷型菌株的分离和筛选有哪些步骤？8.淘汰野生型菌株的方法有哪些？分别简述其原理？9.试述营养缺陷型检出和生长谱鉴定的方法？10.设计通过U.V诱变大肠杆菌而得到组氨酸营养缺陷型突变株的实验程序或方案。11.何为抗阻遏和抗反馈突变型?如何选育?12.原生质体融合的原理和步骤?,