《微生物细胞的破碎》PPT课件.ppt

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1、第三章、微生物细胞的破碎,微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，称为胞外产物。(例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等)还有许多是存在于细胞内(例如青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶等)称为胞内产物。对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液，对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。,细胞壁的组成和结构,细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含物释放出来。微生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜。细胞膜使细胞内外保持一定的浓度差，它主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差，易受渗透压冲击而破碎。细胞破碎的主要阻

2、力来自于细胞壁。,细菌的细胞壁,几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固的骨架肽聚糖组成，是由肽聚糖链借短肽交联而成，使细胞具有一定的形状和强度。短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L丙氮酸D谷氨酸L赖氨酸D丙氨酸。肽聚糖键是N乙酰葡萄糖胺和N乙酰胞壁酸交替地通过（l4）糖苷键联接而成。短肽接在N乙酰胞壁酸上，相邻的短肽又交叉相联，形成了网状结构。,革兰氏阳性菌的细胞壁,革兰氏阳性菌的细胞壁较厚（1550 nm），肽聚糖占40一90，其余是多糖和磷壁酸，革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄（1.52.0nm），最外面还有一较厚的外壁层（810 nm），外壁层主要由脂蛋白，脂多糖组成。破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的

3、网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肤键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。,酵母菌的细胞壁,主要成分为葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比革兰氏阳性菌稍厚，而且其厚度随菌龄增加而增加。细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，再外面是由1，6磷酸二酯键共价连接而成网状结构的甘露聚糖。有甘露聚糖酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。,真菌的细胞壁,大多数真菌的多糖壁，主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以（13）键连接，某些以（l6）键连接），几丁质（以微纤维状态存在）,糖蛋

4、白。真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。,细胞壁的结构和细胞的破碎,破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状结构的共价键。在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结构和组成显得特别重要，可用来作为选择溶菌酶和化学方法的依据。,微生物细胞的破碎技术机械方法球磨机 高压匀浆器 X-press法 超声波破碎 非机械方法 酶解渗透压冲击冻结和融化干燥法化学法,球磨机 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部

5、分解决。,球磨机,高压匀浆器 采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂,高压匀浆法,适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。,X-press法一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25C至-30 C形成冰晶体，利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，该法对冷冻融解敏感的生化物质不适用。,超声波法细胞的破碎是由于超声波的空

6、穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果级差。该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。,超声波破碎仪,酶解法,利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷键，使脂多糖解离

7、，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂,自溶作用,是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。,渗透压冲击,是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，入达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适

8、的。,冻结-融化法,将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。,干燥法,可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质。干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。,化学法,用酸碱及表面活性剂处理，可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。某些脂溶性溶剂也能作为化学处理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，这些试剂容易引起生化物质破坏，

9、还会带来分离和回收化学物质的问题。,破碎方法的选择,选择合适的破碎方法需要考虑下列因素：细胞的数量；所需要的产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性；要达到的破碎程度及破碎所必要的速度，尽可能采用最温和的方法；具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术。,破碎率的评价,破碎率的评价细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：Y(%)=(N0-N)/N0100N0原始细胞数量 N经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量目前N0和N主要通过下面的方法获得,各种破碎方法的评述,高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。但在

10、机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。,各种破碎方法的评述,非机械法一般仅适用于小规模应用。渗透压冲击和冻结融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性.,破碎方法的选择依据,处理量高压匀浆和珠磨机处理量大，速度快，适用于工业生产产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性以及产物在细胞中的位置生化物质的稳定性细胞的数量和细胞壁的强度破碎程度提取分离的难易总之，适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进行权衡。,破碎率的评价,直接计数法在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。间接计数法间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等）。通过做法是将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量上清中的蛋白质含量。,