《微生物工程》PPT课件.ppt

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1、生物工程（第7-10周）05431-33 班 江宁（6：40am班车）周二 B310周五（单周）B211 2008-04-08,第三章 微生物工程,第一节 概述 微生物工程（又称为发酵工程）：是指应用微生物为人类制造有益产品及提供服务的技术。,微生物工程基本原理：微生物细胞一方面可以看成一种催化剂，它能促使生物物质之间的转化；另一方面又可以将之看成一种微小的生物反应器，细胞外物质透过微生物细胞周围的细胞壁和细胞膜进入微生物体内，然后再由微生物体内的酶系统的催化作用，把反应物转化成产品，并释放出来。因此，人们可以利用微生物体内特定的酶系所进行的催化作用(代谢作用)，把原材料转变成人们需要的产品，

2、如各种抗生素、氨基酸、有机酸、维生素等。,微生物工程的发展：上古之时，人类即以简单的自然发酵技术生产乳酪、啤酒、酱醋及加工皮革等，相传8000年前苏米尔人已掌握制作啤酒技术，6000年前埃及人已能制作面包，5000多年前我国酿酒技术已相当精湛。这一时期的发酵技术以非纯种微生物自然发酵工艺为标志，但当时人们并不清楚发酵过程的实质；1857年Pasteuer L发现发酵过程是微生物作用的结果，随后德国科学家Robert Kooh首先提出微生物纯种培养的理论，并首先发明了固体培养基，标志着以纯种微生物发酵为特性的近代发酵工业的诞生。,1870年以后，Pasteur等观察到一种微生物对另一种微生物具有

3、拮抗作用，并预计这种拮抗作用能应用于治疗疾病。1928年，英国细菌学家Alexander Fleming偶然发现，污染在金黄色葡萄球菌培养皿上的点青霉能抑制细菌的生长。当时他指出，能够抑制细菌生长的活性成分是一种由点青霉产生的、被称为青霉素的物质所致。但这个重要的发现限于当时的社会条件，没能及时地得到重视。直到第二次世界大站爆发以后，由于医疗的需要，Florey和Chain等重新对点状青霉的拮抗原理进行研究，经过几年的努力，终于分离提纯了青霉素。1944年底他们首次使用青霉素进行治疗，疗效出人意料的显著。于是，在美国北方地区实验室的帮助下，于1945年前后实现了大规模生产。这一具有划时代意义的

4、工作，为现代抗生素工业奠定了基础，同时掀起了寻找新抗生素的热潮，一批具有临床应用、农业及畜牧业应用价值的抗生素相继被发现。抗生素工业的崛起，不仅对很多微生物发酵工艺的发展起到了先驱作用，同时还为现代发酵工业积累了丰富经验，建立了一整套的研究和生产方法。,十九世纪50年代和60年代发酵工业的发展除了抗生素生产品种不断增加，其主要的发展是微生物发酵产品范围的不断扩大，如氨基酸发酵、核苷酸发酵和对石油微生物的研究应用等，显示出发酵工程的广阔应用前景。,第一节 发酵工程中的微生物一、微生物菌种保藏 微生物菌种在多次传代中，会发生遗传性的变异，而且退化性的变异是大量的，久置的菌种还会死亡，所以微生物菌种

5、应妥善保藏，使之能长期保持存活、不退化，便于生产和科研使用。菌种保藏的原理是根据菌种的生理、生化特点，创造条件使菌体的代谢处于不活泼的状态。保藏时，先挑选优良的纯种，最好是选取它们的休眠体（孢子、芽孢等），然后创造一个最有利于休眠的环境条件（如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等），以降低菌种代谢活动的速度，达到延长保存期的目的。一种较好的保藏方法，首先要求能较长期地保存原有菌种的优良特性，但也要考虑方法本身的经济简便。至于具体采用哪种方法，要根据菌种特性及具体条件决定。,（一）斜面低温保藏法 斜面低温保藏法是最早使用而且现今仍然普遍采用的方法。具体方法是将菌种接种于所要求的培养基上，置最适温度下

6、培养，待得到健壮的菌体后，放在4左右，湿度小于70%的条件下保藏，每间隔一定时间重新移植培养1次。一般，细菌每月移植一次，防线菌每3个月移植一次，酵母菌每46个月移植一次，丝状真菌每4个月移植一次。保存期间应注意冰箱温度，不能波动太大，切忌保存在0以下，否则培养基会结冰脱水，造成菌种性能的衰退和迅速死亡。其优点是操作比较简单，不需要特殊设备，能够随时接种以便复试和观察所保存的菌株是否死亡、变异、退化或污染等；缺点是菌株经过反复传代，遗传性状容易发生变异，且保藏时间短。,（二）、液体石蜡封藏法 在长好菌苔的斜面试管中，加入灭过菌的液体石蜡，可防止或减少培养基内水分蒸发，隔绝培养物与氧的接触，从而

7、降低微生物的代谢活动，推迟细胞老化，延长了保存时间。适用于不能利用石蜡油作碳源的微生物的保藏。方法为选用优质纯净无色中性的液体石蜡，经121加压蒸汽灭菌30min，然后在150170烘箱中干燥12h，使水汽蒸发，石蜡油变清。再按无菌操作将灭菌的石蜡油注人长好菌苔的斜面试管中，液面高出斜面lcm。这种方法比较简便易行，比斜面定期移植法的保藏时间长，但石蜡油管的转接和搬运都很不方便。部分工业上的生产菌株也不易用此法保藏，因其容易造成生产能力的下降。,（三）、真空冷冻干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法是在较低的温度下(-15以下)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。为防止冻结和

8、水分不断升华对细胞的损害，采用保护剂来制备细胞悬液。经过冷冻干燥的微生物的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异或死亡，因此菌种可以保存很长时间，一般510年，最多可达15年之久。真空冷冻干燥保藏法是目前保存菌种的一种比较好的方法。此法适用的微生物种类多，它能使菌种长时间保持活力，又能减少经常移植引起的变异。冻干的菌种密封于小的安瓿管中，适于大批量的保存。,（四）、液氮超低温保藏法 微生物在-130的低温下，所有的代谢活动暂时停止而生命延续，微生物菌种得以长期保存。可通过加入保护剂来降低细胞内溶液的冰点，减少冰晶对细胞的伤害。其方法是取合适的培养物，以510的甘油或二甲亚砜(DMSO)制成孢

9、子悬液或菌悬液，浓度以大于108个ml为宜。将此悬液注入无菌的安瓿管或聚丙烯小管内，密封。采用专用冷冻温度控制仪以每lmin降低1的速度，从O降至-35，然后取出直接放入液氮中。保藏的菌种如需用时，将安瓿管由液氮中取出，立即置于3840温水浴中，振荡，直到全部融化为止，开启移种。液氮保藏法在实际应用中尚存在一些问题，如需要经常补充液氮，保藏菌种的管理费用高，菌种的取出也不如冻干管方便。但这种方法可用微生物的多种培养材料进行保藏，不论孢子或菌体、液体培养或固体培养、菌落或斜面均可。此法是目前最可靠的一种长期保存菌种的方法。,（五）、其他干燥保藏法 保藏微生物菌种最关键的几个要点是干燥、隔氧、低温

10、、避光，单就干燥而言可有多种形式的干燥保藏，虽然形式不同，但原理类似，都是将微生物细胞或孢子附着在一种基物上进行干燥，然后加以保存。例如用沙、土或沙土混合，明胶、硅胶、滤纸、麸皮、陶瓷玻璃珠等作附着剂或载体粘联上细胞干燥后保存。最常用的如沙土保藏法等。,沙土管保藏法的具体操作如下：取细沙除去有机杂质及铁屑，过4060目筛；取庭园土过100120目筛，洗净。将细土与沙按1：2(WW)混合，分装入小管内约2cm高，加棉塞，于121灭菌1h，间歇灭菌35次。将菌苔已长好的斜面，注入无菌水35ml，用接种针轻轻将菌苔刮下，制成菌悬液，接种0.20.3ml菌悬液人沙土管中，然后放在装有干燥剂(如无水氯化

11、钙)的真空干燥器中，接通真空泵，抽干(一般46h即可抽干，管内沙土成松散状)。干燥后的沙土管放在干燥器内置4冰箱中保存。此法适用于产孢子的微生物，如产芽孢的细菌、放线菌和丝状真菌等，也是保存抗生素产生菌常用的方法。其缺点是存活率低，变异率高。以上这几种保藏方法中，以斜面低温保藏法和液体石蜡封藏法最为简便，沙土管保藏法次之，真空冷冻干燥保藏法最为复杂。但是，在保藏效果上则恰好相反。,（六）、菌种保藏的注意事项 1、在整个保存处理过程中要防止杂菌污染，并一定要做无菌检查。2、保藏所用的菌种要在新鲜的斜面上生长丰满，生长时间不宜过长。3、保藏过程中要防止菌种退化现象的发生，及时采用有效方法复壮，传代

12、次数过多容易退化。4、菌种制备过程是保持菌种优良特性的一个重要环节。接种斜面不宜过密，接种量必须控制适当，使菌落能充分生长好。,二、菌种选育 菌种选育是微生物工程的关键技术，主要方法有传统的自然选育、诱变育种以及现代的原生质体融合、代谢调控与基因工程等。1.自然选育 自然选育是一种纯种选育的方法。它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰变型菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株。因此，它能达到纯化、复壮菌种、稳定生产的目的。自然选育有时也可用来选育高产突变株，不过这种正突变的几率很低，获得优良菌种的可能性极小，因此也就难以依赖自然选育来获得高产突变株。自然选育一般包括单孢

13、子悬浮液的制备、分离及单菌落培养、筛选等操作过程，为保持生产菌种的稳定性，自然选育常作为日常工作的一部分。,2.自发突变与定向培育 微生物生长过程中会以一定频率自发突变，而定向培育是指用某一特定因素长期处理某一微生物培养物，同时不断对它们进行传代，以达到累积并选择相应的自发突变体的一种古老的育种方法。由于自发突变 的频率较低，变异程度较轻微，所以培育新种的过程十分缓慢。与诱变育种、杂交育种和基因 工程技术相比，定向培育法带有“守株待兔”的性质，除某些抗性突变外，一般要相当长的时间。近年来，用梯度平板法筛选抗代谢拮抗物（结构类似物）的变异菌株，以提高相应代谢产物产量。如，异烟肼与吡哆醇结构相似，

14、是其代谢拮抗物，在酵母中利用此法获得了吡哆醇的高产菌株。,定向培育抗异烟肼的吡哆醇高产菌株的方法：先在培养皿中加入10ml的一般琼脂培养基，使皿底斜放，待凝固后，将皿底放平，再在原先的培养基上倒10ml含有适当浓度(据实验而定)的异烟肼的培养基，待凝。用此法制成的琼脂平板上存在着一个由浓到稀的异烟肼的浓度梯度。然后在平板表面涂大量微生物细胞，培养后，出现图(右)所示的结果。这是因为，右边是低浓度异烟肼区域，因此长满了原始的敏感菌，而左侧是高浓度异烟肼区，该区中微生物的生长受到了抑制。只有在适中的部位才出现少数由抗异烟肼细胞形成的菌落。这类抗性菌落是由于供试菌中个别细胞产生了某种自发突变，所以形

15、成了抗异烟肼的突变体。根据微生物产生抗药性的原理，它们可能产生了分解异烟肼的酶类，也可能通过合成更高浓度的代谢产物(吡哆醇)来克服异烟肼的竞争性抑制作用。实验结果证明，多数菌株因发生了后一类的突变才获得抗性。因此，利用梯度平板法可达到定向培育某一代谢产物高产菌株的目的。,3.诱变育种 本法是指人为地采用物理及化学方法使微生物基因产生突变的育种技术。诱变因素分为物理、化学及生物三类。,物理诱变因子 物理诱变因子主要包括紫外线（UV）、X射线（X-ray），射线（-ray）、快中子（FN）、射线、超声波、激光等，其中以紫外线辐照使用最为普遍，其它物理诱变因子则受设备条件的限制，难以普及。,化学诱变

16、剂 化学诱变剂是一些能和DNA起作用，改变其结构，并引起遗传变异的化学物质。其稳定性与温度、光照、pH、化合物的半衰期以及与溶剂是否起反应等因素有关。据其与微生物DNA作用方式的不同，可分为三类：（1）烷化剂类化合物：它能与一个或几个核酸碱基起反应，引起DNA复制时碱基配对的转换而发生遗传变异，这是一类在诱变育种中普遍使用的化学诱变剂。如氮介（NM）、乙烯亚胺（EI）、硫酸二乙酯（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍（NTG）、亚硝酸（HNO2）等。（2）碱基类似物：它们能够掺入到DNA分子中而引起遗传变异，如5-溴尿嘧啶（5-Bu）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、5-氨基尿嘧啶、6-氯胸腺

17、嘧啶、2-氨基嘌呤、6-氯嘌呤和8-氮鸟嘌呤等类似物。碱基类似物诱发基因突变可导致碱基对的转换，这种诱变易产生回复突变。,（3）诱变剂插入（移码诱变剂）：包括吖啶黄、吖啶橙等吖啶类化合物。这类化合物的平面三环结构可插入DNA双螺旋的邻近碱基对之间，造成DNA链上碱基的添加或缺失，从而造成碱基突变点后全部遗传密码转录和翻译错误，引起菌种变异。,生物诱变剂 噬菌体可作为诱变剂应用于抗噬菌体菌种的选育，其作用原理可能与传递遗传信息，诱发抗性突变有关。,诱变育种一般分为出发菌株的选择、诱变和筛选三个步骤 第一步：出发菌株的选择。出发菌株是用于诱变的原始菌株，挑选合适的出发菌株对提高育种效率有重要意义。

18、选择出发菌株时，应考虑以下几个问题：.出发菌株的稳定性，尽量挑选纯系菌株，以排除异核体与异质体菌株，因此对选定的出发菌株常需通过自然选育进一步纯化；.选用具备某种优良特性的菌株，如土霉素、四环素的通氨补料工艺的成功，是因为选育了一系列能把较高的糖、氨通过合成途径转化成抗生素的新菌株；.挑选对诱变剂敏感的菌株，以提高突变频率；.菌种的生理状态及生长发育时间，因为诱变剂对处于转录状态或翻译状态的菌种效应要比静止状态或休眠状态的菌种敏感得多。一般细菌处理营养体，并以处于对数生长期的菌体为佳。真菌和放线菌则处理它们的孢子，或处于刚开始萌发状态的孢子。为了保证菌体和诱变剂均匀接触，出发菌株都必须制备成单

19、细胞（孢子）悬浮液，严格控制单孢子的分散度在95%以上。,第二步：诱变剂的选择。能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂，其选择对诱变成功与否很重要。大多数诱变剂在诱发生物体发生突变的同时造成生物体的大量死亡。诱变剂的作用原理很多，目前使用的诱变剂基本上可分为物理诱变因子、化学诱变剂和生物诱变因子三大类。在选择诱变剂时，应考虑试验菌株的遗传背景，因为各种诱变剂有不同的作用机制，一种诱变剂的作用常主要集中在DNA的某些特异部位上，多次反复用同一种诱变因子处理易出现“饱和”或回复突变现象，因此诱变时常采用多种不同的诱变因子或复合因子诱变。,第三步：突变株的筛选。因为突变的不定向性，优良突变株的产生频

20、率极低，如何在较短时间内从大量变异的菌株中把极少数的优良突变株筛选出来，需要设计一个高效率的筛选方案。常用的筛选方法有两种，即随机筛选和半理性化筛选。随机筛选：随机筛选指菌种经诱变处理后，凭经验随机选择一定数量的菌落，其中包括未发生突变的野生型菌株和发生突变后的正向及负向突变株，再进行摇瓶筛选。半理性化筛选：近年来，随着遗传学、生物化学知识的积累，人们对多种抗生素生物合成途径及代谢调控机制的了解不断深入，抗生素产生菌的推理选育技术应运而生，即根据已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来设计筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。,传统的微生物育

21、种方法推动了抗生素生产乃至整个发酵工业的发展，但这种选育方法费时费事，而且是盲目的，不能定向。后来由于对微生物的有性杂交，准性生殖和原核微生物物种基因重组现象的研究，实践中又出现了杂交育种的新技术。1978年，第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出了原生质体融合的育种方法，20世纪70年代，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术基因工程应运而生，这是处于分子水平的定向育种，它给生产实践带来了飞跃的发展。4.杂交育种 杂交育种一般指将两个基因型不同的菌株通过接合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。杂交育种是选用已知性状的供体菌株和受体菌株作为亲本，把不同菌株的优良性状集中于重

22、组体中。因此杂交育种具有定向育种的性质。杂交后的杂种不仅能克服原有菌种活力衰退的趋势，而且，杂交育种使得遗传物质重新组合，扩大了变异范围，改变产品质量和产量。,5.原生质体融合 用脱壁酶处理将微生物细胞壁出去，制成原生质体，再用聚乙二醇（PEG）促进原生质体发生融合，从而获得融合子，这一技术叫原生质体融合。原生质体融合的重组频率高于普通杂交方法，并实现了种间、属间的融合，为亲缘关系较远的、性能差异较大的菌株实现杂交，开辟了一条有效的途径。,6.基因工程 基因工程是现代生物技术的一个重要组成部分，是对传统遗传学研究方法进行的全新革命，此项技术可完成超远缘杂交。其基本含义是指按照人的意志，将某一生

23、物体（供体）的遗传信息在体外经人工与载体相接（重组），构成重组DNA分子，然后转入另一微生物体（受体）细胞中，使外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。因此，基因工程是人们在分子生物学理论指导下的一种自觉的、能像工程一样可事先设计和控制的育种技术。,第二节 发酵设备及消毒灭菌一、发酵设备 发酵设备包括：（一）主发酵设备：种子罐和发酵罐（二）辅助设备：无菌空气和培养基制备（三）发酵液预处理设备：（四）粗产品提取设备(五）产品精制与干燥设备（六）流出液回收、利用和处理设备,（一）发酵罐的基本类型：1、搅拌釜反应器（stirred tank reactor,STR)：包括罐体、搅拌器、挡板、冷却装置

24、、轴封等部件。利用机械搅拌器的作用，使无菌空气与发酵液充分混合，促进氧的溶解。2、鼓泡式反应器(bubble column)：气体由底部高压引入，利用通气中产生的上升的空气泡使发酵液混合。3、气升式反应器(airlift reactor)：内置挡板型和外置循环通道型，在通入空气的一侧由于液体密度降低使液面上升，这样在反应器内形成液体环流，使培养基混合。,（二）发酵辅助设备：主要包括：无菌空气系统、灭菌系统、发酵车间管道和阀门 发酵过程中所用的大量无菌空气也是用过滤除菌法。传统的过滤方式是深层过滤，所采用的过滤介质有棉花、玻璃纤维，活性炭，石棉滤板和活性炭纤维素等。深层过滤的除菌效果靠多种物理因

25、素的共同作用来完成，这些因素主要包括沉降作用、扩散作用、惯性撞击作用、拦截作用和静电吸咐作用等。深层过滤所用的介质有着良好的过滤效果，在生产中已长期延用。但它们存在着使用寿命短、更换作业麻烦的缺点。为克服这些缺点并进一步降低工业使用成本，人们又开发了一些新的过滤介质，如烧结金属板、烧结金属管、烧结玻璃纤维，以及硝酸纤维酯、聚砜、聚四氟乙烯、尼龙微孔滤膜等。这些过滤介质具有与深层过滤相同的过滤除菌效果，且使用寿命较长，介质更换作业简便，因而使用起来要方便得多。,从大气空间采集的空气，在进过滤器之前，还要经过一系列复杂的处理过程，以尽量除去其中的粉尘、油和水，从而确保进罐空气的洁净。,二、培养基

26、培养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。它是微生物的营养基础，是合成代谢产物的物质来源。培养基成分和配比合适与否，对微生物生长发育、物质代谢、发酵产物的积累以及生产工艺等都有很大的影响。只有选用适宜的培养基成分和配方，才能充分发挥微生物合成代谢产物的能力获得良好的生产效果。一种良好培养基的确定，往往要经过长期的反复的试验，并不断调整改进，逐渐趋于完善。同时，良好的培养基组成并不是一成不变的，应根据菌种特性、发酵条件和工艺的改变进行相应的调整、改善。除培养基组成外，还需考虑其他培养条件的控制，才能发挥其最大性能。,根据微生物对营养的要求，任何培养基都应具备微生物生长所

27、需要的六大营养要素，即碳源、氮源、无机盐、生长因子和水。在发酵过程中，为提高产物的量或减少杂质的生成，有时还添加前体、诱导物或抑制剂等成分。培养基配好后必须立即进行灭菌，否则会因杂菌生长而破坏其固有成分和性质。,1、碳源 碳源是组成培养基的主要成分之一。它可为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体细胞所必需的碳成分，还为菌体合成目的产物提供所需的碳成分。常用的碳源主要有碳水化合物、脂类、有机酸和烃类。在某些特殊情况下(例如碳源贫乏等)，蛋白质及其降解物如氨基酸等也可以被某些微生物作为碳源。微生物的种类不同，利用不同碳源的能力也不同。例如，假单抱菌屑中的有些菌可以利用90种以上的含碳化合物；有的

28、微生物利用碳源物质的能力极为有限，如某些甲基营养型细茵只能利用甲醇或甲烷生长。,（一）、培养基的成分及功能,对于异养微生物来说，糖类是最广泛使用的碳源。单糖，特别是葡萄糖极易被利用，几乎所有的微生物都能利用葡萄糖，它可以由玉米淀粉、马铃薯淀粉经酸或酶水解制得。葡萄糖可作为加速微生物生长的一种有效的糖，但是过多的葡萄糖会加重菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物不能完全氧化而累积在菌体或培养基中，如丙酮酸、乳酸、乙酸等导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。另外，有些葡萄糖的分解产物，虽然不导致pH下降，但它能阻遏或抑制某些产物合成所必需的酶的形

29、成或酶的活性，即发生葡萄糖效应。蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等糖类物质等也是常用的碳源。,2、氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质，如氨基酸、蛋白质、核酸等和含氮的目的产物如青霉素、链霉素等抗生素。在特殊环境中，如有些厌氧菌在无氧和缺糖时，也可将氮源(氨基酸)当作能源用。氮源可分为有机氮源和无机氮源两大类。常用的有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉(即玉米麸质粉)、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体等。它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢，最终用于合成菌体细胞物质和含氮的目的产物。,发酵工业中首选的一种氮源是黄豆饼粉，但由于黄豆的产地和加工方

30、法不同，对发酵的影响也很大。如在红霉素生产时应该用热榨的黄豆饼粉，而在链霉素发酵时应该用冷榨的黄豆饼粉。黄豆的不同产地及其不同的加工方法不仅影响抗生素的发酵单位，还影响各组分的生物合成。玉米浆是一种很容易被微生物利用的良好氮源。玉米浆中含有磷酸肌醇，对促进红霉素、链霉素、青霉素和土霉素等品种的生产有积极作用。因玉米浆含有较多的有机酸，所以pH在4.0左右。由于玉米的来源和加工条件不同，玉米浆的成分常有较大的波动，在使用时应注意适当调配。有机氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外，往往还含有少量糖类、脂肪、无机盐、维生素、某些生长因子和目的产物合成所需的调节物、前体等，因此能否选择一种或几种

31、合适的有机氮源是工业发酵培养基成功与否的关键。,常用的无机氮源有铵盐(如氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵)，硝酸盐(如硝酸钠、硝酸钾)和氨水等。微生物对它们的吸收利用一般比有机氮源快，所以也称为迅速利用的氮源。这类氮源在抗生素发酵工业中也会出现类似于葡萄糖效应的现象，即由于微生物快速吸收利用而使其代谢物阻遏或抑制了参与抗生素生物合成的有关酶的形成和活力，使抗生素产量大幅度下降。培养基中的无机氮源被微生物迅速利用后的另一个特点是常会引起pH的变化，如用(NH4)2SO4或NaNO3作为氮源时，被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用(代谢)后能形成酸性物质的无机氮

32、源(如硫酸铵)称为生理酸性物质；经菌体代谢后能产生碱性物质的无机氮源(如硝酸钠)称为生理碱性物质。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。,氨水在发酵过程中常作为pH调节剂，它也是一种容易被利用的氮源，在许多抗生素发酵中都采用通氨工艺。在采用通氨工艺时应注意两个问题：一是氨水碱性较强，为防止局部碱性过强，应多次小量加入，并在通氨时要加强搅拌；二是氨水中含有多种嗜碱性微生物，因此在使用前应用石棉等过滤介质进行除菌过滤，这样可防止因通氨而引起的污染。,3、无机盐 无机盐为微生物生长提供必要的矿物质元素。这些元素参与酶的组成，激活酶活性，维持细胞结构的稳定性，调节细胞渗透压，控

33、制细胞的氧化还原电位。无机盐对微生物的生长发育相代谢产物的生物合成影响很大。在生产实践中，应根据菌种的不同特性和发酵要求，合理选择和使用无机盐，发挥其在发酵过程中的重要作用。根据微生物对无机盐的需求量，通常将无机盐分为主要元素和微量元素两类。主要元素如磷、硫、钾、镁、钙、钠等，所需浓度在10-310-4mol/L范围内。凡所需浓度在10-610-8mol/L范围内的元素，则称为微量元素，如Cu、Zn、Mn、Mo和Co等。Fe介于主要元素和微量元素之间。,这种区分带有人为和相对性质，对不同的微生物来说，往往有很大差别。例如，G-细菌所需的Mg比G+细菌高10倍。微量元素需求量极少，因此，混杂在水

34、或其他营养物中的极微数量就能满足微生物的需要，无特殊原因，配制培养基时没有必要另外加入。工业发酵中，常用的无机磷盐有KH2PO4、K2HPO4、Na H2PO4，无机硫化物有MgSO4、FeSO4、MnSO4，镁盐有MgSO4，钾盐有KH2PO4、KNO3。,4、生长因子 有些微生物即使在具有合适的水分、碳源、氮源、无机盐等的条件下，还不能生长或生长不好，但如果加入少量酵母粉或动物肝脏的浸出液，则生长良好。这是由于酵母粉及动物肝脏中存在某些微生物生长所必需的有机物质，但其需要量不大，通常把这些特殊的营养物质称为生长因子。生长因子根据其化学结构及代谢功能可分成三类，即维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶。

35、维生素是所发现的第一类生长因子，大多数维生素是辅酶的组成成分，例如烟酸经胺化生成烟酰胺，烟酰胺是辅酶I(NAD)和辅酶(NADP)的组成成分；通过烟酰胺的氧化还原催化微生物的生物氧化作用。有些氨基酸是多种微生物的生长因子，这与它们缺乏合成这些氨基酸的酶有关。嘌呤和嘧啶也是许多微生物所需要的生长因子，它们的主要功能是构成核酸和辅酶。,5、水 水是微生物最基本的营养物质。首先，水是微生物细胞内主要组成成分，它在微生物细胞中含量达7090，微生物生长必须有水。其次，微生物特别是单细胞微生物由于没有特殊的摄食及排泄器官，它的营养物、代谢物、氧气等必须溶解于水后才能通过细胞表面进行正常的活动。同时，细胞

36、中的水直接参加代谢过程中的许多反应。此外，由于水的比热大，传热快，能有效地吸收代谢过程中所释放的热量，使细胞内的温度不致骤然升高，且有利于放热，可以调节细胞的温度和保持环境温度的稳定。由此可见，水的功能是多方面的，它为微生物生长繁殖和合成目的产物提供了必需的生理环境。,6、前体 在微生物合成抗生素过程中，有些化合物能被微生物直接利用来构成抗生素分子结构的一部分，而化合物本身的结构没有大的变化，这些物质称为抗生素的前体。前体最早是从青霉素生产中发现的，在青霉素发酵培养时添加玉米浆后，青霉素可从20/ml增加到100/m1。进一步研究表明发酵单位增长的主要原因是玉米浆中含有苯乙胺，它能被优先结合到

37、青霉素分子中去，从而提高了青霉素G的产量。以后的有关青霉素生物合成的研究结果表明，青霉素合成的能力决定于其侧链的合成，即侧链的合成是整个青霉素生物合成过程中的限速步骤；另外发现加入不同的侧链能够得到一系列青霉素产物。因此，通过在基础培养基中加入及中间补料苯乙酸的方法来制备青霉素G，加入苯氧乙酸来生产青霉素V。应该指出，很多前体物质如苯乙酸等浓度过高时对菌体会产生毒性，菌体还具有将前体氧化分解的能力。因此在生产中为了减少毒性和提高前体的利用率，常采用少量多次的流加工艺。,7、诱导物或刺激剂 所谓诱导物是指一些具有调节抗生素生物合成能力的小分子物质，当在微生物发酵过程中添加这些小分子物质后，能够使

38、那些缺乏这种物质而不能合成其目的产物的阻断突变株恢复其生产能力，或是在生产菌株中添加这些物质后能大幅度提高其生产能力。如存在于酵母膏中的B因子(3-磷酸丁酰-腺苷)可使利福霉素产生菌的生产能力成倍增长。近年来，在对微生物代谢调控的研究中还发现某些物质能够刺激抗生素等次级代谢物的生物合成。如甲硫氨酸或亮氨酸对头孢菌素C生物合成的刺激作用，巴比妥能促进链霉素生物合成等，推测其能诱导产生参与这些代谢产物生物合成的酶。,8、抑制剂 在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物，或使正常代谢的中间产物积累起来。如在四环素发酵时，加入溴化物以减少金霉

39、素的含量。生产利福霉素B时，加入二乙基巴比妥盐可抑制其他利福霉素的生成。,（二）、培养基的种类 培养基按其组成物质的来源可分为合成培养基和天然培养基，前者所用原料的化学成分明确、稳定，但营养单一且价格昂贵，用这种培养基进行实验重现性好、低泡、呈半透明，适用于研究菌种基本代谢和过程的物质变化，不适用于大规模工业生产。发酵工业普遍使用天然培养基，它的原料是一些天然的动植物产品，如花生饼粉、酵母膏、蛋白胨等。天然培养基的特点是营养丰富，适合于微生物的生长繁殖和目的产物的合成。一般天然培养基中不需要另加微量元素、维生素等物质，且组成培养基的原料来源丰富，价格低廉，适用于工业生产。但由于天然培养基的组分

40、复杂，不易重复，故若对原料质量等方面不加控制会严重影响生产的稳定性。,培养基按状态可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。固体培养基比较适用于菌种的分离和保存。半固体培养基即在配好的液体培养基中加入少量琼脂，一般用量为0.50.8，培养基即呈半固体状态，主要用于鉴定菌种、观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等。液体培养基中的8090是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基，它有利于氧和物质的传递。,培养基按其用途一般可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基三种。孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用的固体培养基。这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子

41、并不易引起菌种发生变异。种子培养基一般指一、二级种子罐的培养基和摇瓶培养基，这种培养基主要含有容易被利用的碳源、氮源、无机盐等，使孢子很快发芽、生长以及大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮和使各种有关的初级代谢酶的活力提高。种子培养基要和发酵培养基相适应，成分不应相差太大，以避免进罐后的种子对新环境的适应时间延长。发酵培养基可供菌种生长、繁殖和合成产物。它既要使种子接种后能迅速生长达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需的产物，因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。由于各种培养基的用途不同，其培养基的组成差异也很大。,（三）、

42、发酵设备及培养基灭菌 培养基必须经过灭菌方可使用，目前大多数生产用培养基均采用高压蒸汽灭菌法，如操作控制不当，灭菌时温度偏高，受热时间过长，则营养成分会受到一定程度的破坏。影响这种方法有效程度的因素主要有：待杀灭微生物的种类、待灭培养基的组成、pH值、以及培养基中颗粒成分的粒度。一般来说，生物的营养体在较低温度下很快就可杀灭；而要杀死微生物的泡子，则需要至少121的高温。在所有的微生物孢子中，因热脂肪芽孢杆菌的孢子对热的耐受性最强，因此，人们常常用它作为检验灭菌是否彻底的指标。表4给出了湿热灭菌法杀死某些微生物所需的灭菌时间和温度。,不同微生物的灭菌时间和温度,常用的加热灭菌方式有高温蒸汽湿热

43、灭菌法和干热灭菌法。湿热灭菌比干热灭菌更为有效，因蒸汽在冷凝时要释放大量的潜能，且蒸汽有强大的穿透力，易于传热，用蒸汽将物料升温至115140保持一定时间，可杀死各种微生物。这种方法普遍被用来对培养基和设备容器进行灭菌。干热灭菌的效果不如湿热灭菌，它只适用于工业要求为灭菌后能保持干燥状态的物料灭菌。实验室规模的玻璃器皿等器具常采用干热灭菌。一般采用干热灭菌的条件是160，120min。,目前在工业生产上通常采用的蒸汽灭菌法，包括实罐灭菌(实消)、空罐灭菌(空消)、连续灭菌(连消)及附属设备灭菌。1、实罐灭菌(实消)实消是将配制好的培养基投入发酵罐中，同时开动搅拌器，通入高温蒸汽进行灭菌。实消的

44、温度一般为121，灭菌时间则视培养基组成、罐容积而定，一般在3060分钟之间。在灭菌过程中，应让高温蒸汽通过所有与发酵罐相连的管道、接口、阀门相电极，以避免在这些部位留下死角而引起杂菌污染。实消又分直接加热和间接加热两种形式。间接加热是使高温蒸汽通过发酵罐的夹层或内部蛇管，与培养基发生热交换；而直接加热则是使经纯化处理、不合杂质的高温蒸汽通入培养基中，使其温度在短时间内升至要求的温度。在蒸汽与培养基直接接触时，有一部分蒸汽要冷凝成水，从而使培养基稀释，因而在配制培养基时应预先扣除这部分冷凝水。,2、空罐灭菌 空罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。空罐灭菌一般维持罐压1.51052.0105Pa、罐温12

45、5130、时间3045min。灭菌时要求总蒸汽压力不低于3.01053.5105Pa。灭菌后为避免罐压急速下降造成负压，要等到经过连续灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却水冷却。,3、培养基连续灭菌 将配好的培养基在高温快速的情况下，向发酵罐输送的同时经过加温、保温、冷却等过程，进行灭菌的方法。其操作步骤大致可分为：（1）培养基预热：将料液预热到6075，避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。（2）连续灭菌：连续灭菌是在连消塔中完成的。连消塔的主要作用是使高温蒸汽与料液迅速接触混合，并使料液温度很快升高到灭菌温度。连续灭菌的温度一般以126132为宜，（3）维持灭菌温度

46、：由于连消塔加热时间较短，光靠这短时间的灭菌是不够的。因此，利用维持罐使料液在灭菌温度下保持57min，以达到灭菌的目的。维持罐的罐压一般维持在4105Pa左右。,（4）冷却：生产上一般采用冷水喷淋冷却，即用冷水在排管外从上向下喷淋，使管内料液逐渐冷却。一般料液冷却到4050后，输送到预先空消过的罐内。在冷水喷淋前，冷却管内应充满填料。连续灭菌的时间短、温度较高，培养基受到的破坏较少，故质量较好。连续灭菌时蒸汽负荷均衡一致，但不足之处是所需设备较多，操作较麻烦，染菌的机会也相应增多。,4、发酵附属设备及管路的灭菌 发酵附属设备有总空气过滤器、管道、计量罐、补料罐等。糖水罐灭菌时罐压为1105P

47、a、时间为30min；油罐(消沫剂罐)灭菌的蒸汽压力为1.51051.8105Pa、时间为60min。总空气过滤器灭菌时，先关闭总进气和出气阀门，开启放气阀门，使总空气过滤器内的压力降到零(表压)。灭菌时的蒸汽压力为3.5105Pa左右，蒸汽自上端输入，上下放气口同时放汽，总过滤器内压控制为1.51052.0105Pa(表压)，灭菌时间为2h。灭菌完毕，自上端输入空气，自上而下吹干过滤介质。管道灭菌的蒸汽压力不应低于3.4105Pa(表压)，灭菌时间为1h。新安装的管道或长期未使用的管道灭菌时间可适当延长到1.5h。灭菌后以无菌空气保压，自然冷却30min即可交付使用。,第三节 发酵过程的控制

48、 一、发酵过程的主要控制参数（一）物理参数1温度（）：指发酵整个过程或不同阶段所维持的温度。它的高低与发酵中的酶反应速率，氧在培养液中的溶解度和传递速率、菌体生长速率和产物结合速率等有密切关系。2压力（Pa）：这是发酵过程中发酵罐维持的压力。罐内维持正压可以防止外界空气中的杂菌侵入而避免污染，以保证纯种培养。同时罐压的高低还与O2与CO2在培养液中的溶解度有关，间接影响菌体代谢。罐压一般维持在0.21050.5105Pa。3搅拌转速（r/min）：指搅拌器在发酵过程中的转动速度，通常以每1min的转速来表示，它的大小与氧容量传递速率与发酵液的均匀性有关。4搅拌功率（kW）：指搅拌器搅拌时所消耗

49、的功率，常指每1m3发酵液所消耗的功率（kW/m3）。,5空气流量（V/Vmin）：空气流量是每1min内每单位体积发酵液通入空气的体积，也是需氧发酵的控制参数。它的大小与氧的传递和其他控制参数有关。一般控制在0.51.0V/Vmin范围内。6黏度（Pas）：黏度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况。它的大小可改变氧传递的阻力，又可表示相对菌体浓度。7浊度（%）：浊度能及时反应单细胞生长状况，对某些产品的生产是极其重要的。8料液流量（L/min）：这是控制流体进料的参数。,（二）化学参数生产或科研中所采用的化学参数有下列几个：1pH（酸碱度）：发酵液的p

50、H是发酵过程中各种产酸和产碱的生化反应的综合结果。它是发酵工艺控制的重要参数之一。它的高低与菌体生长和产物合成有重要的关系。2基质浓度（g或mg%）：指发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。它的变化对产生菌的生长和产物的合成有重要的影响，也是提高代谢产物产量的重要控制手段。因此，在发酵过程中，必须定时测定糖（还原糖和总糖）、氮（氨基氮和铵盐）等基质的浓度。3溶解氧浓度10-6（ppm）或饱和度（%）：溶解氧是需氧菌发酵的必备条件。氧是微生物体内的一系列经细胞色素氧化酶催化产能反应的最终电子受体，也是合成某些代谢产物的基质，所以，对溶氧浓度大小的影响是多方面的。利用溶氧浓度的变化，可了解产生菌