实验三离心技术及物质代谢实验xuxia.ppt

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1、,实验三 离心技术及物质代谢实验,徐清清,实验内容,离心技术邻甲苯胺法测血糖含量糖酵解中间产物磷酸丙糖的鉴定酶法测定血浆胆固醇（下午）,定义：离心技术（Centrifuge technology）是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。用途：离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一。,离心技术,第一节 离心技术的原理,当一个粒子在高速旋转下会受到离心力F作用，其大小为：。m：沉降粒子的有效质量 r：粒子的旋转半径，单位cm：粒子旋转的角速度,离心机转速的表示方法：,1.每分钟转数 Revolut

2、ions Per Minute(rpm)2.相对离心力 Relative Centrifugal Force(RCF),RCF 表示实际离心力相当于地球引力的倍数，常用数字乘“g”来表示。,RCF=1.11910-5(rpm)rrpm：每分钟转数，单位r/ming：重力加速度，约等于980cm/s：单位弧度/秒（rad/s）,相对离心力：,沉降颗粒在离心管中所处位置也不同，则所受离心力不同。因此在描述超速离心条件时，通常用RCF代替rpm，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。,F=m*r,沉降系数,定义：沉降速度与离心力加速度的比值，即单位离心场中颗粒的沉降速度，单

3、位为“S”。S=V/r 人们规定1S=110-13 秒 S=V(D-D)/f 用途：对于某些大分子化合物，当它们的详细结构和分子量不很清楚时，常常用沉降系数这个概念去描述它们。如核糖体RNA有30S亚基和50S亚基，这里的S就是沉降系数。,。,第二节 离心机的主要类型和构造,工业用离心机离心机 制备型离心机 实验用离心机 分析型离心机,制备性离心机,一、制备性离心机的类型：1.普通离心机 2.高速冷冻离心机 3.超速离心机,普通离心机高速冷冻离心机超速离心机,最大转速（rpm）,超速离心机装有真空系统，这是它与高速离心机的主要区别.,转头：包括角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头、连续流动

4、转头 离心管：包括塑料离心管、玻璃离心管、不锈钢离心管,制备性离心机的主要构件：,角式转头,荡平式转头,塑料离心管,玻璃离心管,首先根据待离心液体的性质及体积选用合适的离心管使用各种离心机前，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，对称放置，不得使用奇数个离心管。离心过程中不得随意离开若要在低于室温的温度下离心时，提前预冷注意最高转速，不得超速使用。,离心操作的注意事项,二、胰岛素对血糖含量的影响及测定,实验目的：通过实验方法证实胰岛素对血糖含量的降低作用，即检测家兔注射胰岛素前后血糖浓度的改变.掌握邻甲苯胺法测定血糖浓度。,实验原理：1.胰岛素降血糖的机理：1)促进肌肉、脂肪组织对葡萄糖

5、的通透性，促进葡萄糖进入这些细胞；2)糖原合成,糖原分解；3)糖有氧氧化；4)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶合成糖异生；5)激素敏感性脂肪酶脂肪动员。,2.邻甲苯胺法测血糖含量,葡萄糖在浓酸溶液中（加在含有硼酸的冰醋溶液中），水 浴加热至100左右，脱水生成羟甲基呋喃甲醛（或称羟甲基糠醛），后者能与邻甲苯胺缩合生成蓝绿色的化合物，根据颜色深浅并进行630 nm波长比色测定其含量。,实验方法1.胰岛素对血糖含量的影响：家兔注射胰岛素前后 血糖含量的变化。1）取饥饿12小时家兔一只，记录体重。2）采取血标本：用二甲苯棉球涂擦家兔耳部，使局部血管 扩张，然后用刀片纵行切开边缘耳静脉，让血液自然滴 入试管中，

6、收集约2ml，待血凝固后，分离血清。3）按家兔体重，皮下或腹腔注射1.5单位kg胰岛素，记录 注射时间，待40分钟后，用同样方法取血，分离血清。4）将注射胰岛素前后的血清，分别测定血糖含量。,2.血糖含量的测定：1.1）取试管四支，按下表操作,2）混匀，置沸水浴中加热10分钟，取出立即置冷水中冷却3）用630nm波长，以空白管校正吸光度为0，分别测定各管吸光度值4）计算：,180,目前国内医院多采用葡萄糖氧化酶法和邻甲苯胺法测定血糖。,注意问题,二甲苯能扩血管但是它有溶血的作用，所以切开取血前要晾一会。沸水浴时注意安全；管口朝墙，防止高温溅出伤到自己。,糖酵解中间产物的鉴定,【实验目的】检测糖

7、酵解中间产物磷酸丙糖的生成。【实验原理】,酶-SH+ICH2COOH酶S-CH2COOH+HI,红棕色,【实验方法】取试管3支，编号，按下表进行操作记录三管所发生的情况，并加以简要的分析CCL3COOH的作用：强酸，使糖酵解的全部酶失活。一碘醋酸的作用：使3-磷酸甘油醛脱氢酶失活。硫酸肼的作用：稳定磷酸丙糖，使其不向其它方向转变。,实验注意事项：试管、移液管洗干净；加入的试剂正确；混匀；成腙反应前，溶液必须先碱化并在室温放置10min，目的是使磷酸丙糖中的磷酸基水解脱去，生成的颜色比较稳定。,血清胆固醇测定（酶法）,【实验目的】1.了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。2.掌握血清胆固醇测定

8、的临床意义。,血清中总胆固醇包括胆固醇酯(CE,70%)和游离型胆固醇(FC,30%)。胆固醇酯酶（CEH）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）的作用下氧化生成4胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（POD）催化与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在500 nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下：,【实验原理】,1.标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA抗凝，不可用草酸盐、氟化物。2.取试管3支，编号，按下表操作。,【实验方法】,3.混匀后，37水浴保温15分钟，在500 nm波长处比 色，以空白管调零，读取各管吸光度。,【计算】A标本 CHO（mmol/L）=标准液浓度 A标准【标准液】胆固醇 5.17 mmol/L（200mg/dL）【正常参考范围】3.105.70mmol/L,注意问题,胆固醇含量测定：4个组做空白和标准管，样品管每个组都做。测吸光度值时把空白管和标准管放入分光光度计，只换样品液即可。,