专题一 基因工程选修三DNA重组技术的基本工具,基因工程的基本操作程序,基因工程的应用,蛋白质工程的崛起.ppt

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1、2.基因、DNA、染色体之间是怎样的关系？,按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,一、基因工程的概念,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,定向地改造生物的遗传性状,基因重组,一、基因工程的概念,基因工程操作依据的理论基础,细胞生物都以DNA作为遗传物质，且其基本结构是相同的；,各种生物表达基因共用一套密码子。,棉花细胞(不能抗虫),抗虫基因,转基因抗虫棉(能抗虫),苏云金芽孢杆菌,目的基因,导入,剪刀,针线,运载体,检测 表达,受体细胞,分子手术刀,分子缝合针,

2、分子运输车,培育转基因抗虫棉的简要过程,主要来源于原核生物,属名头字母+种名头2字母,现已从300微生物中分离出约4000种限制酶,1.分子手术刀 限制酶,识别双链DNA分子中特定核苷酸序列,切割特定序列中的特定位点,限制酶作用的化学键,主要来源于原核生物,属名头字母+种名头2字母,现已从300微生物中分离出约4000种限制酶,1.分子手术刀 限制酶,能够识别双链DNA分子某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,黏性末端或平末端,DNA1,重组DNA,由于切割后的载体和目的基因具有相同的末端，故重组DNA存在3中可能连接。即、。,重组DNA一定是载体-目

3、的基因连接吗？,载体-目的基因,载体-载体,目的基因-目的基因,DNA连接酶连接重组DNA分子,E.coli DNA连接酶,T4 DNA连接酶,只作用于 末端,主要作用于 末端，还可作用于 末端,磷酸二酯键,黏性,平,黏性,通过形成新的磷酸二酯键，形成重组DNA,2.分子缝合针DNA连接酶,复习,基因工程的原理？基因工程的基本工具？限制酶的作用特点及作用结果？DNA连接酶的种类及作用特点？DNA连接酶和DNA聚合酶的比较？,催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,将单个核苷酸加到DNA片段上，形成磷酸二酯键,能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；,目的基因怎样才能

4、遗传到子细胞呢？,将外源基因导入受体细胞,具有特殊的标记基因，便于进行筛选；,质粒、噬菌体的衍生物和动植物病毒,一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子。,对受体细胞无害,具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因插入；,载体能对受体细胞有害吗？,载体怎样才能具有能连接不同目的基因的潜能呢？,目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？,3.分子运输车载体,已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。,练习,既含有抗四环素基因 也含有抗氨苄青霉素基因,只含

5、有抗四环素基因,只含有抗氨苄青霉素基因,既不含有抗四环素基因 也不含有抗氨苄青霉素基因,三大工具,分子手术刀限制性内切酶,分子缝合针DNA连接酶,分子运输车运载体,小节：基因工程的工具,原核细胞基因结构示意图,mRNA,真核细胞基因结构示意图,目的基因的获取,基因表达载体的构建,目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,基因工程基本操作的四个步

6、骤,1,2,3,4,（一）目的基因主要是_。,编码蛋白质的结构基因,（三）获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、化学方法人工合成,一、目的基因的获取,（二）目的基因的来源：,1、从自然界中已有物种中分离出来,2、人工的方法合成,1.基因文库：,2.基因文库的分类：,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,（一）从基因文库中直接获取,提取某种生物的全部DNA,限制酶切,一定大小的DNA片段,与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,3.基因文库的构建方法,（1）基因组文库,某种生物的单链mR

7、NA,单链互补DNA,双链DNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,逆转录酶,DNA聚合酶,（2）部分基因文库,2.原理：,体外模拟双链DNA复制,（二）利用PCR技术扩增目的基因,四种脱氧核苷酸(dNTP),一对引物：,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA(含有目的基因),3.条件：,与目的基因的起始段互补核苷酸序列,一段已知目的基因的核苷酸序列,4.前提：,变性（90-95）：目的基因DNA受热变性后解链为单链；,复性（55-65）：引物与单链相应互补序列结合；,延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的DNA链；,约2n,5.过程,PCR技术扩增与DNA

8、复制的比较,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,主要细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,例：根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,（三）化学方法人工合成的目的基因,适用：基因比较小，核苷酸序列已知,1.目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,二、基因表达载体的构建,2.基因表达载体的组成：,启动子+目的基因+终止子+标记基因,（一）转化：,（二）方法,目的

9、基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程。,受体细胞,稳定,表达,三、将目的基因导入受体细胞,1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法 农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,原理：植物体受损伤时，伤口细胞会分泌酚类化合物，吸引农杆菌，农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程：,优点：,经济有效,（2）基因枪法（3）花粉管通道法,缺点：成本较高,受体细胞(单子叶植物),我国科学家独创，转基因抗虫棉,2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：常用的动物受体细胞：受精卵和卵细胞,3、将目

10、的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞(吸收环境中DNA生理状态)表达载体(缓冲液)与感受态细胞混合(温度)感受态细胞吸收DNA分子,（二）方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞法,三、将目的基因导入受体细胞,四、目的基因的检测与鉴定,（一）检测（分子水平）,1、检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因,提取转基因生物的基因组DNA用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记，以此做探针使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交

11、带，表明染色体已插入染色体DNA中,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,（1）方法:,分子杂交,方法:,抗原-抗体杂交,（2）过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,（二）鉴定（个体生物学水平）,抗虫、抗病接种实验，活性比较等,人体细胞,质粒,大肠杆菌,目的基因(人胰岛素基因),用同一种限制酶进行酶切,DNA连接酶连接目的基因和质粒,重组质粒(重组DNA),重组质粒导入大肠杆菌细胞,繁殖,人胰岛素,复制目的基因,获取目的基因从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目

12、的基因化学方法人工合成目的基因构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞植物、动物、微生物目的基因的检测与鉴定检测：分子水平是否插入、转录、翻译鉴定：个体水平,小节:基因工程的基本操作程序,基因工程的基本工具？限制酶的特点？DNA连接酶和载体的种类？基因工程的基本操作程序？获取目的基因的方法？基因工程的核心步骤是？基因表达载体的组成？将抗虫基因转移到棉花细胞中遗传和表达称为？将目的基因导入植物、动物、微生物细胞的方法？T-DNA的特点？目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键？目的基因的检测与鉴定的方法？,复习,一、植物基因工程硕果累累,转基因工程技术主要用于提高农

13、作物的抗逆能力,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。,(一)抗虫转基因植物,杀虫基因：,Bt毒蛋白基因蛋白酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因植物凝集素基因,Bt毒蛋白基因蛋白酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因植物凝集素基因,产生的抑制剂可与害虫消化道的蛋白酶结合,淀粉酶抑制剂抑制昆虫消化道中的淀粉酶活性,合成的糖蛋白可与昆虫肠道粘膜上的某种物质结合,编码的蛋白质在害虫肠道降解成有毒的多肽,转基因抗虫棉,(二)抗病转基因植物,病原微生物：,主要有病毒、真菌和细菌等。,抗病转基因植物采用的基因：,抗真菌转基因植物采用的基因：,病毒外壳蛋白基因（CP基因）病毒复制酶基因,几丁质酶基因抗毒素合成基因,(

14、三)抗逆转基因植物,可以调节细胞渗透压的基因抗冻蛋白基因抗除草剂基因,(四)利用转基因改良植物的品质,将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物；改变这些氨基酸合成途径中某种关键酶的活性。,例如：将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米，赖氨酸含量提高30%。,将控制番茄果实成熟的基因导入番茄，获得转基因延熟番茄；,将植物花青素代谢有关的基因导入花卉植物矮牵牛中，出现颜色变异。,二、动物基因工程前景广阔,1.用于提高动物生长速度,2.用于改善畜产品的品质,外源生长素基因,将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组,普通鼠和生长速度加快的转基因鼠（右）,3.用转基因的动物生产药物,乳腺生物反应器乳房生物反应器,将

15、药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起。,获取目的基因（例如血清蛋白基因）,构建基因表达载体（在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子）,显微注射导入哺乳动物受精卵中,形成胚胎,将胚胎送入母体动物,发育成转基因动物（只有在产下的雌性动物个体中，转入的基因才能表达）,4.用转基因的动物作器官移植的供体,1、供体动物：2、存在的难题：3、解决方法：,将供体基因组导入某种基因调节因子，以抑制抗原决定基因的表达；或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。,猪,免疫排斥,三.基因工程药品异军突起,利用基因工程方法制造“工程菌”，可高效率地生产出各种高质

16、量、低成本的药品。,我国已生产的产品：白细胞介素-2、干扰素、乙肝疫苗等。,近20种，年产值达30亿。,工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。,作用：胰岛素是治疗糖尿病的特效药。传统生产方法：主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取45g胰岛素。产量低，价格昂贵。基因工程方法：1979年，科学家将动物体内的胰岛素基因与大肠杆菌DNA分子重组，并在大肠杆菌内实现了表达。1982年，美国一家基因公司用基因工程方法生产的胰岛素投入市场，售价降低了30%50%。,基因工程药品 胰岛素,基因工程药品 干扰素,化学本质：是病毒侵入动物或人体细胞后产生的一种糖蛋白

17、。作用：抗病毒的特效药。,干扰素产品,基因工程药品 生长激素,治疗侏儒症的唯一方法：是向人体注射生长激素。传统生产方法：需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。,四、基因治疗曙光初照,1）原理：,把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，达到治疗疾病的目的。,2）实例：,复合型免疫缺陷症,3）基因治疗的方法,体外基因治疗：,体内基因治疗：,先从病人体内获得某种细胞(T细胞)，进行培养，体外进行基因转移，筛选成功细胞扩增培养，最后

18、重新输入患者体内。,直接向人体组织细胞中转移基因的治疗方法。,4）用于基因治疗的基因种类,1.正常基因取代病变基因；弥补病变基因；,2.反义基因产生mRNA与病变mRNA互补；,3.编码可以杀死癌细胞的蛋白酶基因；,多聚半乳糖醛酸酶(PG)能降解果胶使细胞壁破损。成熟的番茄果实中，PG合成显著增加，能使果实变红变软，但不利于保鲜。利用基因工程减少PG基因的表达，可延长果实保质期。科学家将PG基因反向接到Ti质粒上，导入番茄细胞中，得到转基因番茄，具体操作流程如图。据图回答下列问题：(原生质体是去掉细胞壁的植物细胞),(1)若已获取PG的mRNA，可通过_获取PG基因。重组质粒转移到大肠杆菌中的

19、目的是_。,(2)用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有_的培养基进行筛选，理由是_。之后，还需将其置于质量分数为25%的蔗糖溶液中，观察细胞_现象来鉴别细胞壁是否再生。,(3)由于导入的目的基因能转录出反义RNA，且能与_互补结合，因此可抑制PG基因表达的翻译过程。若_，则可确定转基因番茄培育成功。,知识回顾,基因工程的实质是什么？,将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本来不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。,思考：,基因工程有没有局限？基因工程产生的蛋白质有没有不足？,一、蛋白质工程崛起的缘由,例如：,玉米中赖氨酸含量比较低,天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）,二

20、氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）,天冬氨酸激酶（异亮氨酸）,二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）,玉米中赖氨酸含量可提高数倍,二、蛋白质工程的基本原理,与基因工程的关系：,蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。,蛋白质工程流程图：,蛋白质三维结构,氨基酸序列多肽链,基因DNA,mRNA,从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相应的脱氧核苷酸序列,蛋白质工程的主要步骤通常包括：,（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能 地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;（4）设计各种处理条件

21、，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如定点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。,某多肽链的一段氨基酸序列是：丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸丙氨酸：GCU、GCC、GCA、GCG 色氨酸：UGG 赖氨酸：AAA、AAG 甲硫氨酸：AUG 苯丙氨酸：UUU、UUC,讨论：1、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。2、确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改 造目的基因（DNA）？,讨论,蛋白质工程目前的现状：成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。,三、蛋白质工程的进展与前景,诱人前景：,用蛋白质工程制成电子元件：优点：体积小、耗电少和效率高,联系作者：,