《基因工程讲》PPT课件.ppt

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1、第四章 哺乳动物基因工程,一、哺乳动物基因转移的遗传选择标记,迄今为止，已知的绝大多数的哺乳动物病毒载体，除了牛乳头病毒载体外，都得附加上标记基因，才能进行有效的选择。,常用的这些标记基因有：胸苷激酶基因(tk)、二氢叶酸还原酶基因(dhfr)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、细菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(Eco-gpt)以及细菌的新霉素磷酸转移酶基因(Eco-neo）等。,哺乳动物基因转染实验常用的显性选择标记,1嘌呤和嘧啶的生物合成,（1）嘌呤的生物合成,APRT：腺嘌呤磷酸核糖基转移酶；HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶；XGPRT：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。

2、,（2）嘧啶的生物合成,2、胸苷激酶基因选择系统,(1)TK-细胞 胸苷激酶(thymidin kinase，TK)是核苷酸合成代谢途径中的一种酶，能够把胸苷转换为胸苷一磷酸。在单纯疱疹病毒(HSV)中发现的胸苷激酶的编码基因(tk)，几乎在所有的真核细胞中都能有效地表达。正是由于这种缘故，以确定哺乳动物基因转移可能性为目标的大多数早期实验，都是采用这个基因作为遗传选择标记。,在胸苷激酶基因选择系统中，首先得建立具TK-表型的细胞株。这可以通过诱变加选择的程序获得。,具体的做法：把细胞培养在补加有一种胸苷类似物5-溴尿嘧啶脱氧核苷(BUdR)的培养基中，在胸苷激酶的催化下，BUdR便掺入到细胞

3、的DNA分子上，致使DNA复制出现错误。具有BUdR-DNA的细胞对UV特别敏感，被迅速地杀死，而少数突变的TK-细胞便能够存活下来。应用这种方法已经分离到许多种培养细胞的TK-突变体。,目前最常用的一种TK-细胞是小鼠L细胞的TK-突变株。这种突变株的优点是产生回复突变的频率相当低，而且容易被外源DNA所转化，所以使用起来很方便，即便在不使用tk基因作选择标记的情况下，也可用作受体细胞。,(2)HAT选择法,由于选择TK+细胞的培养基含有次黄嘌呤(hypoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(thymidine)，所以叫做HAT选择法。,基本原理：如果用叶酸的类似物氨

4、基蝶呤(APT)处理细胞，二氢叶酸还原酶便被抑制，培养基中的还原辅助因子四氢叶酸因得不到补充而逐渐耗尽，于是从dUMP合成dTTP，以及dATP和dGTP的重新合成便因此被阻断。但次黄嘌呤是dATP和dGTP补救合成途径的一种底物，培养基中补加有此种物质时，细胞能逾越氨基蝶呤的抑制作用，继续合成出这些脱氧嘌呤三磷酸(dATP和dGTP)。,由于在HAT培养基中补加有外源的胸苷，所以TK+细胞通过胸苷激酶的作用可把它合成为dTTP，继续存活下去；而TK-细胞则不会发生这种合成，因而死亡。把正常的tk基因导入TK-细胞，它们也就照样能够存活下去。所以使用HAT培养基，能够选择出由tk基因转化而来的

5、TK+细胞。,(3)共转化选择 1)共转化选择的基本过程,HAT选择法可以用来分离以tk基因作选择标记的外源DNA转化的受体细胞。,在磷酸钙沉淀中，两种DNA分子的混合物，能够同时转化受体细胞。根据这种共转化现象，结合磷酸钙共沉淀技术，人们可以将无选择标记的DNA同具tk选择标记基因的DNA进行混合转化，发展出了共转化选择体系，从而解决了不具tk选择标记基因的转化子的选择问题。,3二氢叶酸还原酶基因选择系统,(1)基本原理,二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)在真核细胞的核苷酸生物合成中起着重要的作用，它催化二氢叶酸(DHF)还原成四氢叶酸(THF)。这个

6、反应过程受到叶酸的类似物氨基蝶呤(aminopterin，APT)和氨甲蝶呤(methotrexate，MTX)的竞争性抑制。,如果细胞的培养基中含有这些抑制物，例如氨甲蝶呤，其浓度只要达0.1gml，就会阻断核苷酸生物合成，最终导致细胞死亡。,（2）常用的基因:,1)小鼠3T6成纤维细胞的突变系3T6400来源的突变dhfr基因。由它合成的突变二氢叶酸还原酶与正常酶相比，同MTX的结合能力下降了270倍。因此，用突变细胞呈抗性反应的MTX浓度，就可以把野生型细胞杀死，达到了显性选择的目的。如果把突变基因dhfrMTX导入正常的细胞，转化子也就获得了抗性。,2)另一个dhfr显性选择标记是位于

7、细菌抗药性因子R388上的dhfr基因。它编码的二氢叶酸还原酶，实际上就可以抗MTX的抑制作用。,4氯霉素乙酰转移酶基因选择系统,氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyl transferase，CAT)是由大肠杆菌Tn9转座子上的cat基因编码的，它能够催化乙酰基团从乙酰辅酶A转移到氯霉素分子上，导致一个或两个羟基发生乙酰化作用，从而使其失去活性。这个基因可以作为检测外源基因导入真核细胞的一种十分敏感的标记基因，尤其是适用于瞬时表达的研究。,5氨基糖苷磷酸转移酶基因选择系统,氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因也经常用Eco-neo表示，它是氨基糖苷类抗菌素的抗性基因，所编

8、码的APH酶可以使此类抗菌素，如G418失去活性。氨基糖苷抗菌素G418，即3-脱氧链霉胺(3-deoxystreptamine)，在结构上同卡那霉素、新霉素及庆大霉素十分相似。它通过抑制70S核糖体的功能而阻断真核细胞中的蛋白质合成，造成细胞死亡。因此，为我们提供了一种不需要特殊突变细胞的显性选择系统。,二、外源DNA导入哺乳动物细胞的方法,1磷酸钙转染技术,(1)磷酸钙转染的基本步骤,通过磷酸钙DNA共沉淀，将外源基因导入哺乳动物细胞的技术程序，最初是由Graham等人于1973年创立的。应用这种方法，能够将任何的外源DNA有效地导入培养的哺乳动物细胞，目前仍被许多实验室广泛地使用。磷酸钙

9、转染法的基本操作过程包括：,将待转染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2DNA溶液；,在不断搅拌过程中，逐滴缓慢地加入到Hepes磷酸钙溶液中去，形成一种磷酸钙-DNA共沉淀；,然后用吸管仔细转移共沉淀物，使之粘附到培养的哺乳动物单层细胞表面，就会迅速地被细胞所捕获。,保温几小时后，将细胞洗净，并更换新鲜的培养液，继续培养至最终实现外源DNA的高水平表达。依培养细胞的不同类型而异，平均每个培养皿中约有10的细胞捕获了外源转染DNA。据报道，添加甘油或DMSO(二甲基亚砜)会增加某些类型细胞吸收外源DNA的数量。,(2)影响磷酸钙转染效率的因素,*DNA磷酸钙共沉淀物中DNA的数量；,*共

10、沉淀物与细胞接触的保温时间；,*甘油或DMSO等促进因子作用的持续时间等。,2DEAE-葡聚糖转染技术,二乙氨乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran)，简称DEAE-葡聚糖，是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源的DNA，实现瞬时的有效表达。这种转染技术最初是设计用来分析脊髓灰质炎病毒(Polis virus)RNA的感染性，其后经过改良又被用着分析SV40及多瘤病毒DNA的感染性。,(1)DEAE葡聚糖转染的一般程序,处理方式：1）先使病毒的DNA与DEAE-葡聚糖混合，形成DNADEAE葡聚糖复合物；2）受体细胞先用DEAE-葡聚糖溶液作预处理

11、，然后再用来与转染的DNA接触。,注意：处理前要用等渗溶液漂洗，除去培养液中的血清成分。,DEAE-葡聚糖的使用浓度为100-1000gml之间。一般在低浓度(200gml)和较长的持续处理时间(8h或16h)的条件下，哺乳动物细胞捕获外源DNA的效率比较高。若在DEAE-葡聚糖处理之后，再加入DMSO等促进因子，还可以进一步提高效率。最高感染率可达80。,(2)DEAE葡聚糖转染的可能机理及影响因素,分子机理不十分清楚，曾经提出过几种较为合理的解释。一种认为DEAE-葡聚糖同DNA结合成复合物，可以保护DNA免受核酸酶的降解作用；另一种则认为DEAE-葡聚糖可以同细胞膜发生作用，从而使DNA

12、能够容易地穿过细胞表面进入细胞内部。,有许多因素都会影响DEAE-葡聚糖的转染效率，其中以细胞的数量、DNA的浓度和DEAE-葡聚糖的浓度最为重要。,大体上说，按每个直径10cm的培养皿中加入1-10g的转染DNA，并使用每毫升培养基含100400g DEAE-葡聚糖的溶液，对于绝大多数类型的细胞，都能得到很好的转染效率。由于DEAE-葡聚糖对有些细胞具有毒性，因此用低浓度溶液作短时间的接触反应较为合适。,(3)DEAE-葡聚糖转染法的评价,优点:方法简单、重复性高、以及转染效率高于磷酸钙法等。,不足：不能产生稳定的转化细胞系。原因可能是同DNA组装成微型染色体有关。因为有实验报道，一旦质粒D

13、NA进入经过DEAE-葡聚糖处理的细胞，它就会迅速地组装成含核小体的微型染色体。,磷酸钙转染技术十分有效而且易于重复，但最适转染条件的范围比较窄，为此发展出技术条件并不十分苛刻的聚阳离子-DMSO转染技术。,3聚阳离子-DMSO转染技术,实验原理：用聚阳离子Polybrene(聚溴化季铵阳离子的商品名)处理，增加DNA对细胞表面的吸附能力；再用2530的DMSO短暂处理细胞以增加膜的通透性，提高对DNA的捕获数量。,按此法测定反转录病毒DNA的转化效率，结果是同DNA的加入量成正比，而且不需要加运载DNA(carrier DNA)就可得到稳定的转化。聚阳离子-DMSO转染技术的通用性尚未验证，

14、但已知可适用于鸡胚细胞和小鼠成纤维细胞的转化。,4基因显微注射技术,应用玻璃显微注射器，可以把重组DNA直接注射到哺乳动物细胞的细胞质或细胞核。,根据DNA注射的方式不同，可以把显微注射区分为真正的显微注射(true microinjection)法和“穿刺”(pricking)导入法两种。,显微注射，DNA是由注射针直接注入细胞；而在穿刺中，DNA是处在细胞周围培养基中，它通过穿刺形成的小孔进入细胞的内部，或是随穿刺的针头一道进入的。,(1)显微注射法,用显微注射法转移基因的效率明显地超出其它方法。如把tk-DNA注射到小鼠tk-细胞，结果有50100的受注射细胞能瞬时表达胸苷激酶的活性。获

15、得稳定转化子的数量，取决于注射的DNA的性质。,如一个对比实验，一组用pBR322HSV-1 tk重组DNA注射，结果在5001000个受注射细胞中，只有一个转变成稳定的转化子；另一组用连接着特定的SV40序列的pBR322HSV-1 tk重组DNA注射，结果平均每5个受注射细胞中便有一个稳定的转化子，转化频率达20。,穿刺法是使用显微注射针穿刺细胞及细胞核，而把外源DNA导入培养细胞或细胞核的一种特殊的显微注射法。,(2)穿刺法,操作过程：,I、取对数生长期的细胞，加入蛋白酶及EDTA溶液，于37下消化15分钟；,II、移去消化液，并用培养基漂洗细胞之后，在每个直径为6.0cm的培养皿中接种

16、(15)x103细胞，置37下继续培养过夜；,III、在穿刺前弃去培养基，用pH7.2的磷酸缓冲液(PBS)漂洗2次，然后加入浓度为51000gml的供体DNA，覆盖于培养细胞表面；,IV、对细胞进行穿刺处理；,V、穿刺后，马上移去PBSDNA溶液，换上正常培养基，随后再换上选择培养基。,5电穿孔DNA转移技术,操作程序：,将盛有细胞和DNA混合液的特制小容器置于电脉冲仪的正负电极之间，在0下加高压(2.04.0kV)电脉冲10秒钟后，将处理的细胞转移到新鲜培养基中生长2天，再行筛选。,经过这样处理所得到的存活细胞的回收率约有6080。,如果在电穿孔之前，先用秋水仙酰胺(colcemid)预处

17、理细胞10小时，可提高转化效率310倍。这很可能是由于在这类中期停顿(metaphase arrest)的细胞中，细胞核处于无膜状态，或是此时核膜具有较高通透性的缘故。,应用电穿孔技术转移基因到哺乳动物受体细胞，平均每l05个活细胞中，可获得2530个转化子。现在这种方法已成功地应用于许多细胞系，包括小鼠淋巴细胞、人淋巴细胞、大鼠垂体细胞及成纤维细胞等。,6脂质体载体法,以脂质体为媒介的外源DNA导入受体的方法，叫做脂质转染法。,第一种常用的脂质转染法是，将外源DNA与阳离子型的脂质体混合形成DNA-脂质复合物(DNA-lipid complex)。这种复合物可有效地被受体细胞捕获，实现基因的

18、高频率转移，故这种方法又叫做DNA-脂质复合物转染法。,*在这个过程中，DNA并不是被包装在脂质体的内部，而是通过两者之间的静电引力作用结合在一起的。,第二种常用的脂质转染法叫做脂质体载体法。它是将外源DNA包装在脂质体的内部，然后通过脂质体的双层膜同受体细胞膜之间的融合作用，使外源DNA进入细胞质，尔后再进入细胞核，实现基因的表达。,7哺乳动物细胞基因定点插入,(1)基因定点插入的分子基础,20世纪80年代后期发展的基因定点插入(gene targeting)技术，通过在转染细胞中发生的外源基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组(homologous combination)，使外源基因

19、定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。,基因定点插入的分子基础是在外源定点插入基因与内源核基因组目标基因之间，必须存在一段适当长度的同源的DNA序列。,基因定点插入的基本过程包括如下几个步骤：,首先是将外源基因，以及两侧与内源目标基因同源的DNA片段，克隆在具有选择性标记基因(例如neo)的载体分子上，构成专用的基因定点插入载体(gene targeting vector)；,选用适当的限制性内切酶切割载体，使之线性化；然后转化受体细胞。由于用于定点插入的外源基因的两侧，与内源核基因组上的目标基因或座位之间存在着同源的DNA序列，因此当线性化的载体DNA被导入受体细

20、胞之后，两者便会彼此配对。,在重组酶RecBCD的作用下，两条同源DNA的相同部位便会发生同源重组，实现外源基因在核基因组DNA上的定点整合。,现已知道有多方面的因素，诸如受体细胞的生理状态以及外源DNA的转染方式等，都会影响到基因定点插入的效率。鉴于哺乳动物基因定点整合效率低下的缘故，因此掌握并利用这些影响因素，对于提高基因定点插入效率无疑是十分有益的。,基因定向插入的效率取决于DNA同源重组的频率，它是与两条重组DNA分子之间的同源序列的长度密切相关的。,应用正负选择法，已经测定出基因定向插入所需的DNA同源性的有效长度。长度为25bp的同源序列即可发生同源重组。在哺乳动物细胞中，当DNA

21、同源性的有效长度介于2591800bp之间时，同源序列越长，基因定向插入的效率也就越高，两者成正比；DNA同源性有效长度在2kb以上时，基因定向插入的效率进一步提高，同源程度为14kb时，达到最高值；实验还观察到，当DNA同源序列长度不到200bp时，基因定向插入的效率则会明显地下降。,(2)基因定向插入的类型与应用,根据同源重组过程中外源定向插入基因在核基因组上整合的结果，可将基因定向插入区分为插入型和置换型两种不同的形式。,基因定向插入技术自20世纪80年代诞生以来，经过近20年的发展，迄今已成为基因功能研究的一种强有力的手段。它无论在理论探索还是在实际应用上，都具有重要的价值和广泛的发展

22、前景。其主要的应用有如下几个方面：,第一，应用基因定向插入技术，能够将经体外修饰改造的突变基因或某种新的外源基因，取代受体细胞核基因组上的目标基因，使基因组获得新的遗传信息，以便使科学工作者能够相当有效地检测基因的功能。,第二，应用基因定向插入技术，也可以在核基因组的目标基因序列附近，插入一个具相同调控序列的同源基因拷贝。如此既可形成重复基因，提高表达效率和相关的蛋白质产量，又可能不会破坏目标基因及其邻近基因的功能。,第三，利用基因定向插入技术，还可以在核基因组内部增加一段DNA序列，或造成序列缺失，甚至是单碱基定点突变等，从而达到抑制或纠正目标基因的功能，为遗传疾病的基因治疗提供技术途径。,

23、(3)正负选择法,转染DNA与内源基因组DNA之间的同源重组事件，是由转染DNA的自由末端激发的。一般认为，在酵母细胞中发生同源重组的频率比较高，也容易检测。而哺乳动物细胞转染DNA发生随机整合的机率相当高，而同源重组的频率则相当低。正是由于这种缘故，给哺乳动物细胞的基因定向插入事件的检测造成了很大的困难。,为了克服这种困难，已经发展出了一种用于富集同源重组事件的特殊的试验体系，它涉及到正选择和负选择两个重要内容，所以特称为正负选择（positive-negative selection）法。,基因定向插入载体上有两个选择标记基因：,neo基因叫做正选择标记基因，可抑制抗菌素G418的活性。因

24、此，获得的neo基因的转化细胞，呈G418抗性，能够在含有G418抗菌素的选择培养基中生长、存活。,HSV-tk基因叫做负选择标记基因，它编码的单纯疱疹病毒胸苷激酶，可以把核苷类似物，例如9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(GCV)，转变成为毒性的核苷酸，造成细胞中毒死亡。因此，选择培养基中的GCV能够特异性地杀死表达HSV-tk基因的转化细胞。,(5)哺乳动物细胞基因敲除实验,胚胎干细胞(embryonic stem cell)简称ES细胞，系指哺乳动物囊胚期胚胎(即胚泡)的内细胞团中的一种未分化的细胞。它具有如同癌细胞那样的无限繁殖和多潜能(Multipotential)的发育能力，

25、并且可在体外培养条件下长期保持未分化的状态。当将经过体外遗传操作(例如导入了打靶基因)的ES细胞重新转移到胚泡之内，并移植在养母子宫中生长，便可发育成嵌合动物。,由于ES细胞具有诸多方面的优越性，故特别适合于用作基因敲除实验(gene knock-out experiment)。不过ES细胞株的建立，却是一件十分困难的事情，迄今为止还只有为数不多的ES细胞株系可供有关研究工作使用。,在这里我们选用小鼠ES细胞为例，阐述哺乳动物细胞基因敲除实验的基本过程：,第一步：根据受体细胞核基因组中待敲除的目标基因之核苷酸序列的结构特征，在体外构成一种具有失活基因或纠正基因的DNA片段。然后将此片段克隆在一

26、种具有选择标记基因的置换型基因定向插入载体上。,第二步：将此载体经适当限制酶消化作用而被线性化之后，转染给培养的小鼠ES细胞。由于定向插入DNA片段的两侧与目标基因两端之间存在同源的DNA序列，因此它可通过同源重组置换核基因组中的具功能活性的目标基因，也就是说把目标基因敲除掉。,第三步：应用正负选择法分离出已成功地敲除掉了目标基因的ES细胞克隆，这样的ES细胞系亦叫做突变的ES细胞。,第四步：挑选生活力旺盛的突变的ES细胞，体外注射到超数排卵的供体小鼠的胚泡中。这个过程叫做胚胎干细胞转移(embryonic stem cell transfer)。,第五步：将此胚泡移植（Transplant）

27、到受体母鼠，亦称养母(foster mother)的子宫中。由此发育长成的当代转基因小鼠，其个体中含有一定比例的来自ES细胞的细胞群体，称为嵌合鼠。实验中所用的供体小鼠、受体小鼠和提供ES细胞的小鼠，三者均应是属于近交系(inbred line)。,三、转化载体,（一）SV40病毒载体,在动物基因工程的研究领域中，关于病毒载体方面的工作，占据着相当重要的地位。已有许多实验证明，一些具有DNA基因组或其生活史中出现有DNA阶段的真核生物的病毒，经改建后，都可以发展成为动物基因工程的载体。这主要是由于动物病毒具有如下的特点：,动物病毒含有能够被真核细胞识别的有效的启动子。这些启动子不但可以启动动物

28、基因工程中常用的一些标记基因的表达，而且还能够启动克隆的外源基因的表达。,有许多种动物病毒，在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平。因此，任何插入在动物病毒基因组内的外源基因，在病毒感染之后的很短时间内，其剂量就会得到显著的增加，并实现有效的表达。,病毒具有控制自我复制的顺式元件和反式作用因子。这些病毒经过基因操作改造之后，可以发展成为能够在细胞内长时间保持高拷贝外源基因的复制型质粒载体。,有些动物病毒，在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上。,病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接受器(acceptor)，因此外壳蛋白质可作为感染剂(infectious age

29、nts)能够将外源基因高效地导入寄主细胞。用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒(pseudovirions)，即构成了一种高效的转化体系。,1SV40病毒的基本生物学特性,猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40，SV40)载体的发展速度，远远超过了其它动物病毒载体。其主要原因在于：,*目前有关该病毒的分子生物学知识已有了相当明显的进步。SV40病毒的基因组是一种环形双链的DNA，其大小仅有5243bp，很适于基因操作。,*它是头一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒，而且对其复制及转录方面的特性也有了相当深刻的了解。,(1)SV40病毒的生命周

30、期,根据SV40感染作用的不同效应，可将其寄主细胞分成三种不同的类型。受体细胞：SV40感染细胞之后，产生感染性的病毒颗粒，并使寄主细胞裂解。如，猿猴细胞。非受体细胞：感染细胞后，不会产生感染性颗粒，而是病毒基因组整合到寄主细胞的染色体上，于是细胞便被转化，如，啮齿动物细胞。半受体细胞：SV40接触细胞后，只有1一2会产生出感染性的病毒，大多数整合到基因组上，从而使细胞转化。如，人体细胞。,(2)SV40病毒的基础分子生物学,SV40病毒是一种小型的20面体的蛋白质颗粒，由三种病毒外壳蛋白质VPl、VP2和VP3构成，中间包装着一条环形的病毒基因组DNA。,同其它病毒不同，SV40 DNA能同

31、除了H1之外的所有寄主细胞组蛋白(H4、H2a、H2b和H3)相结合。这些组蛋白使病毒DNA分子紧缩成真核染色质所特有的念珠状核小体，这种结构特称为微型染色体(minichromosome)。,感染之后的SV40基因组，输送到细胞核内进行转录和复制。如同大多数的病毒一样，SV40病毒基因组表达的时间顺序是相当严格的。据此可将其区分为早期表达区和晚期表达区。,围绕在SV40 DNA复制起点周围约400bp的DNA区段，是十分引人注意的。例如，现在已经弄清紧挨这个起点的DNA序列，是调节早期和晚期初级转录本合成的控制信号。早期转录本的合成，就是由位于这个区段内的一对72核苷酸序列串联而成的强化因子

32、序列激活的。,SV40病毒基因组表达的一个重要特点是，它的RNA剪辑模式非常复杂。通过不同的剪辑途径，早期初级转录本加工成2种不同的早期mRNA；而晚期的初级转录本加工成3种不同的晚期mRNA。,2种早期mRNA分别编码大T抗原和小t抗原(即肿瘤蛋白质或抗原)。晚期转录本按照其特定的沉降系数，可区分为16S、18S和19S三种mRNA，它们分别编码VPl、VP3和VP2病毒蛋白质。其中18S和19S两种mRNA，具有一段相同的编码序列。,2取代型重组病毒载体,野生型的SV40病毒颗粒的包装范围相当严格，超过其基因组大小(5.2kb)的重组DNA就不能够被包装为成熟的病毒颗粒。而且，SV40还存

33、在着寄主细胞的局限性，它只能在受体细胞中增殖，并最终导致寄主细胞的死亡，这样就不能作长期的培养使用。因此，野生型的SV40病毒必须经过改造之后，才能发展成为基因克隆的有用载体。,(1)晚期区段取代载体 实验中已经观察到，缺失了整个晚期区段功能的SV40病毒，同可互补这段功能的一种温度敏感(ts)的辅助病毒混合感染时，仍然能够增殖。因此，可以通过取代晚期区段的途径构建SV40病毒载体。最常用的辅助病毒是tsA突变体，它合成一种温度敏感的T抗原。,按照同样的道理，也可以构建出早期区段取代载体(early region replacement vector)。例如，有人曾用一种流感病毒的血细胞凝集素

34、(haemagglutinin)编码区，取代T抗原编码区，构成一种早期区段取代载体。通过由一种辅助病毒提供T抗原，被这种取代载体感染的受体细胞，便会出现正常的裂解周期。,(2)早期区段取代载体,(i)早期区段取代载体,3重组的病毒质粒载体,(1)含有完整早期区段和复制起点的病毒-质粒载体,SV40和多瘤病毒(Polyoma virus)的基因组能够在寄主细胞中快速地复制，并达到相当高的拷贝数。利用这种能力，现在已经发展出了一类特殊的病毒载体。这类病毒载体，实质上是由病毒的早期区段和复制起点同大肠杆菌的质粒分子重组而成的，所以又叫做病毒质粒载体(viralplasmid vector)。,它们既

35、可在大肠杆菌细胞中复制，也能在哺乳动物细胞中复制。,*例如，病毒质粒载体pC10就是一种典型的穿梭载体，其中的早期区段和复制起点来自多瘤病毒，质粒是大肠杆菌的pBR322，克隆的外源DNA是小鼠免疫球蛋白重链基因。多瘤病毒的结构同SV40病毒十分接近，但它的受体细胞是小鼠细胞而非猿猴细胞。将纯化的paCl0DNA导入小鼠细胞。经过46天，每个细胞中累积的拷贝数高达50,000400,000份，从而加强了外源基因的表达能力。,使用SV40病毒的早期区段，同样也可以构建出感染猿猴细胞的病毒质粒载体。,这里必须指出的是，在这种病毒质粒载体中，质粒DNA部分不应含有所谓的“毒性序列”(poison s

36、equence)。已经鉴定出在pBR322质粒中的一段430bp序列。由于某种未知因素的影响，这段序列的存在，会使哺乳动物细胞中的任何DNA复制失效。像pAT153及其它一些pBR322质粒派生载体都已失去了这段毒性序列。因此适合于用来构建哺乳动物的病毒质粒载体。,实验发现，含有SV40-DNA复制起点的任何大小的环形DNA，都能够像质粒一样进行独立的复制。根据这种原理，许多实验室都把只含有SV40 复制起点的DNA片段，即所谓的微型病毒复制子(mini-viral replicon)，插入在大肠杆菌的质粒载体上，构成了一种新型的病毒质粒载体，称为微型病毒复制子质粒载体。,(2)微型病毒复制子

37、-质粒载体,pTBC-1就是一种典型的SV40微型病毒复制子-质粒载体，如果将这种载体导入COS或HFS细胞，它们就能利用细胞提供的T抗原复制出非常大量的拷贝数。可以用来高水平地表达外源蛋白质。,（二）反转录病毒载体,反转录病毒(retroviruses)是一类含单链RNA的动物病毒。它的基因组含有2条相同的正链RNA分子，包装成二倍体病毒颗粒。除此之外，在其病毒颗粒内部还包含有tRNA引物分子、反转录酶、RNaseH和整合酶等组分。,迄今已经在鸟类及哺乳类动物中发现了许多种反转录病毒。例如鸟类的脾坏死病毒(SNV)、鼠类的乳腺肿瘤病毒(MMTV)，莫洛尼氏小鼠白血病病毒(Moloney mu

38、rine leukemia virus，MoMLV)等等。,其中研究得最为详尽的则要数劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)。RSV病毒感染了鸡之后，就会诱发产生肿瘤。从感染细胞中分离出来的反转录病毒的DNA，是一种有用的动物细胞的基因载体。,反转录病毒家族可以分成三种不同的类群：,泡沫病毒(foamy viruses)类群，例如人泡沫病毒(HFV)；,慢病毒(Lentiviruses)类群，例如人免疫缺损病毒(HIV)I型和型，以及绵羊髓鞘脱落病毒(Visna virus)等；,致癌病毒(onco viruses)类群。并非所有本类群的病毒都是致癌的。根据在电子显微镜下

39、观察的病毒颗粒的形态学特征的差异，致癌病毒类群又可区分成A、B、C、D四个类型。,反转录病毒作为动物基因克隆载体的优点：,第一，在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因(oncogene，onc)都能够在正常的细胞中转录。,第二，反转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物和脊椎动物。其中有的还能够在人体细胞中生长。当两种不同的反转录病毒在同一寄主细胞中生长时，就会出现一种DNA被另一种外壳蛋白质包装成假型病毒的奇特现象。由于病毒的寄主范围实质上是由其蛋白质外壳决定的，因此使用这种假型病毒便有可能将某些病毒基因组导入正常无法感染的细胞，从而进一步扩大寄主范围。,第三，反转录病毒具有强启动子，克隆于

40、此类载体上的外源基因有可能得到有效的表达。有些反转录病毒，例如鼠乳腺肿瘤病毒，其启动子的活性功能的开启或关闭可以通过实验手段予以控制。,第四，反转录病毒不但感染效率高，而且通常还不会招致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和形成感染性病毒颗粒的能力。因此，有可能利用反转录病毒作载体，改变动物细胞的基因型，并可遗传到子代细胞。,(三）其它的病毒载体,痘苗病毒(Vaccinia virus)具有双链DNA基因组，同天花的病原体天花病毒(Variola virus)的亲缘关系十分密切。当人们接种了痘苗病毒之后，便可获得对天花的高度免疫性。在DNA重组技术发展之后不

41、久，就有人将外源DNA片段插入到痘苗病毒的基因组中，得到了具有生物活性的重组病毒。根据这一发现，基因工程学家便设想构建能够表达多种病原体抗原的重组痘苗病毒，作为预防这些病原体感染的活疫苗。,1、痘苗病毒载体,乳头瘤病毒(Papilloma viruses)能够感染包括人类在内的多种脊椎动物，产生上皮肿瘤，例如肉疣和乳头瘤。已有研究表明，人乳头瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)能够诱发人宫颈癌(human cervical carcinoma)。可见，此类病毒与人类的关系十分密切。但是只有完全分化的扁平的上皮细胞(epithelial cell)，才能产生感染性的乳头瘤

42、病毒，迄今为止还没有办法在培养的细胞中增殖这种病毒。,2乳头瘤病毒载体,目前对于乳头瘤病毒的分子生物学研究，远远地落后于其它病毒。然而有几种乳头瘤病毒的DNA能够转化培养的细胞，而且在转化的细胞内，病毒的基因组保持游离的多拷贝的状态，每个分离后的细胞可达50一200份。利用乳头瘤病毒基因组这种非整合的特性，克隆在它上面的外源基因的复制与表达，则可免受染色体的控制，而得到大量的扩增，同时又不会导致寄主细胞的裂解死亡。从这点考虑，乳头瘤病毒载体比上面所讨论的整合性载体具有突出的优点，因而在近年很受人们的关注。,腺病毒(Adenoviruses)是一群无囊膜的20面体的病毒，所含的双链DNA的分子大

43、小约为36kb。,3腺病毒载体,腺病毒具有很大的发展为真核基因的表达体系潜力。这首先是因为它的基因组DNA分子量大，可插入较大的外源DNA片段，而且还可以在寄主细胞中大量地增殖。其次，在腺病毒感染周期中，寄主蛋白质合成被关闭掉了，因此能最大限度地合成病毒编码的蛋白质，这种特性为克隆基因蛋白质产物的检测与纯化提供了很大的方便。,构建腺病毒载体的重要步骤是，设法减少其基因组DNA中某些核酸内切限制酶的切割位点的数目。,腺病毒载体的构建,在腺病毒载体的构建过程中，失去某种限制位点的腺病毒DNA是在体外选择的。例如，失去XbaI限制位点的Ad5 DNA的变异体，是先用XbaI切割腺病毒DNA，然后把消

44、化片段重新连接起来之后获得的。根据此类再生片段的感染性，便可筛选出由这些片段重新连接形成的完整的基因组。于是就构建出减少了某种核酸内切限制酶切割位点的腺病毒载体。,由于在腺病毒的两段反向末端重复序列中，只要有一段是完整的，另一段的缺失也就能够得到恢复。因此，可以利用靠近5-末端的El早期基因区克隆外源基因。例如已经证明，Ad2左边末端片段在体外克隆和突变之后，再连接到缺失了左边末端片段的Ad5基因组DNA上，这样的重组体分子感染了人细胞之后，会正确地再生出左边末端片段，从而恢复了腺病毒DNA的末端重复结构，而且子代病毒DNA也是具有感染性的。,应用上述办法，已在El早期基因区引入了若干突变，但

45、假若不提供辅助功能，如此形成的重组的腺病毒是不能够在人HeLa细胞中生长的。同样的道理，如果通过这种办法将外源基因插入在El早期基因区，也就必须提供辅助功能才能完成感染周期。现在通常是用能表达El功能的人细胞系(293细胞)提供这种辅助功能的。,因为腺病毒并不能够感染猿猴细胞，而含有SV40病毒T-抗原的重组分子却可以在这种细胞中表达。因此，构建腺病毒-SV40重组载体可以扩大腺病毒的感染范围，能够在其它非受体细胞(如猿猴细胞)中有效地生长。在体外已经构建成的这类腺病毒-SV40重组载体中，T-抗原基因的表达是在腺病毒主要的晚期启动子控制下进行的。这种类型的腺病毒载体有可能得到进一步的发展。,