《基因工程药物》PPT课件.ppt
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1、1.无性繁殖系的组建,2.基因工程药物的生产,3.基因工程药物的检验,基因工程药物:将生物体内生理活性物质的基因,利用重组DNA技术加以改造,然后使其在细菌、酵母、动物细胞中大量表达的新型药物,第九章基因工程药物,1.无性繁殖系的组建,1.1 人胰岛素工程菌的组建,1.2 人2b型干扰素工程菌的组建,1.3 集落刺激因子工程菌的组建,(1)胰岛素的结构及其生物合成,1.1人胰岛素工程菌的组建,(2)人胰岛素的生产方法:,A.化学合成法制人胰岛素 根据人胰岛素A链和B链的序列,由单个氨基酸从头合成。技术可行,但其生产成本奇高。,B.化学转型法制人胰岛素 猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨
2、基酸的差异,猪的为Ala,人的为Thr,可将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素。但工艺复杂,产品的价格不菲。,C.基因工程法制人胰岛素 1982年,美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素,成为世界上第一个上市的基因工程药物。由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别。,a.A链和B链分别表达法:,由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基,体外二硫键的正确配对率较低,通常只有10%20%,采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。,b.人胰岛素A链和B链同时表达法:,c.人胰岛素原表达法:
3、,由于C肽的存在,胰岛素原能形成良好的空间构象,三对二硫键的正确配对率也相应提高,折叠率高达80%以上,每克最终产品的成本仅50美元。,1.2 人2b型干扰素工程菌的组建,(1)人2b型干扰素基因的获得:应用PCR的方法,从人的染色体片段获得。,(2)重组表达质粒的特点:具有双SD序列。抗病毒活性高,构建过程见书P172图9-2,1.3 集落刺激因子工程菌的组建,(1)RT-PCR法制备GM-CSF cDNA,从正常人血中分离出单核细胞,提取总RNA;引物设计:引物:5端增加有EcoR酶切位点,起始密码子,个组氨酸密码子和凝血酶切位点引物:5端加一个终止密码子和一个BamH酶切位点,PCR扩增
4、产物和质粒pBV220双酶切后,重组连接,挑选氨苄青酶素抗性转化子,经酶切筛选、鉴定,阳性重组子命名为pGM09,(2)GM-CSF重组表达载体的构建,(1)rhG-CSF基因工程菌的培养与发酵,1)发酵用工程菌种的筛选,将保存的菌种接种到LB琼脂平板上,过夜培养。挑取单菌落进行液体培养,取少量经热诱导培养后,用SDS-PAGE分析选取表达量最高的克隆作为发酵用种子,2)发酵培养基的选用,将工程菌接种于种发酵培养基中进行发酵,比较诱导表达结果及收菌量,选取合适的发酵用培养基,2.基因工程药物的生产,2.1 基因工程菌的培养与发酵,3)接种量对发酵的影响,以10或15接种量较适宜,4)溶解氧水平
5、对发酵的影响,5)pH对工程菌生长和表达的影响,前期培养着重工程菌的生长:后期培养着重外源蛋白的表达:,6)热诱导对表达量的影响,热诱导表达的工程菌一般在菌体的对数生长期或对数生长后期,在2min内温度突然升高10 以上。,7)高密度对表达量的影响,高表达的前提下,适当提高菌体密度。,高水平溶解氧(40)有利于外源蛋白的形成.,(2)IFN-2b基因工程菌的培养与发酵工程菌株:SW-IFN2b/DH5工程菌的种子培养:将工程菌接种在LB培养基中,30振摇培养10h.工程菌的发酵:接入种子培养液至发酵罐中,30发酵h,然后在42诱导h完成发酵。,2.2 基因工程药物的分离纯化,(1)影响分离纯化
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