《基因工程原理》PPT课件.ppt

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1、1,第3章基因工程原理,王金发L,2,基因工程是20世纪70年代发展起来的遗传学的一个分支学科,3,基因克隆操作,4,基因工程的应用,5,6,基因工程的对象是基因，所以如果是获得商品的话，就是基因的产品，或是改变了遗传性的细胞和个体。如果要获得效益的话，除了经济效益之外，还有巨大的社会效益。基因工程的对象是基因，而基因要安居才能乐业，也就是说基因需要在宿主细胞中工作，这样，基因工程同一般的土建工程的根本差别在于，它需要在体外操作，然后送到细胞中去进行表现。,3.1 基因工程的特点,7,3.1.1 基因工程与遗传工程,遗传工程(genetic engineering)一词产生于19世纪20年代，

2、是遗传学和工程学相结合的一门技术科学。借用工程技术上的设计思想,在离体条件下,对生物细胞、细胞器、染色体或DNA分子进行按图施工的遗传操作,以求定向地改造生物的遗传性。遗传工程的概念有广义和狭义之分。广义的遗传工程包括传统遗传操作中的杂交技术和现代遗传操作中的基因工程和细胞工程,狭义的遗传工程仅指基因工程。,8,3.1.2 生物技术,生物技术(biotechnology)又称生物工艺学,生物工程学。是根据生物学、化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细胞组分,进而利用生物体所具有的功能元件(如基因、蛋白质)等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术。基因工程、细胞工

3、程、酶工程和发酵工程等是生物技术的主要内容。,9,基因工程(gene engineering)又称基因操作(gene manipulation),重组DNA(recombinant DNA)。基因工程是以分子遗传学为理论基础,以分子生物学和微生物学的现代方法为手段,将不同来源的基因(DNA分子),按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子,然后导入活细胞,以改变生物原有的遗传特性,获得新品种,生产新产品,或是研究基因的结构和功能。,10,体外操作与细胞内表达,11,细胞工程(cell engineering)应用细胞生物学的原理和方法,结合工程学的技术手段,按照人们预先的设计,有计划地改变或创

4、造细胞遗传性的技术,以及在体外大量培养和繁殖细胞,或获得细胞产品,或利用细胞体本身的技术领域。主要内容包括细胞融合、细胞拆合、染色体转移、基因转移、细胞或组织培养等。由于所用细胞的来源不同，细胞工程又分为微生物细胞工程、植物细胞工程、动物细胞工程等。,12,植物细胞工程,13,细胞分泌工程 根据细胞内蛋白质合成和运输理论而发展起来的一项新的细胞工程技术，主要是通过对基因改造，如基因缺失、多效分泌突变、周质泄漏突变或加接信号肽等措施，促进基因产物分泌的技术。,14,酶工程(enzyme engineering)又称酶技术。它是围绕着酶所特有的生化催化特性,结合现代的技术手段,在体外模拟或在常温常

5、压下生成酶反应的产品以及利用重组DNA技术定向改变酶,进行酶的修饰,或酶的全人工合成。其主要内容包括酶的化学修饰、酶的固定化、酶反应器等。,15,蛋白质工程(protein engineering)是更广义上的包括酶工程在内的蛋白质修饰操作,通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特殊功能的非天然蛋白质的技术。主要是根据蛋白质的结构和功能间的相互关系,利用基因工程技术,或用化学方法,合成基因,改造基因,以便合成新的蛋白质,或改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。,16,发酵工程(fermentation engineering)又称微生物工程,微生物发酵工程。利用生物,主要是微生物的某种特定

6、功能,通过现代化工程技术手段,生产有用物质,或把微生物直接用于某种工业化生产的一种技术体系。主要内容包括菌种选育,发酵生产微生物,或植物细胞的代谢产物,生产微生物菌体,最佳培养条件的优化组合等。,17,3.2 基因工程技术的诞生,3.2.1 基因工程的技术准备 基因工程技术的诞生不仅依赖于基因分子生物学理论的发展，同时也有赖于一些重要的分子生物学研究方法的建立。最重要的技术准备是限制性酶的分离纯化、DNA连接酶的分离、大肠杆菌转化技术的突破。到1970年，这三大技术都已经建立，“万事齐备，只欠东风”了。到了19721973年，两位科学助产士Berg和Cohen将基因工程接到了人间。,18,3.

7、2.2 基因工程技术的诞生,19,第一个重组体的构建 1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表了题为“Biochemical methode for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2904-2909,1972”，标志着基因工程技术的诞生

8、。,20,第一个重组体构建,21,SV40病毒是猿猴病毒，是一种直径为450的球形病毒，分子量为28106道尔顿。SV40的DNA是环状双链结构，全长5243个碱基对。SV40DNA上有一个限制性内切酶EcoR的切点。,22,SV40病毒,23,当获得二聚体SV40DNA后，Berg等就证明了环状DNA被内切酶切成线性DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。于是他们进行第二步的实验就是从dvgal DNA中制备含有E.coli的半乳糖操纵子DNA，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功。,24,第一个有功能重组体的构建虽然Berg的工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重组的D

9、NA分子具有生物学功能。1973年，等在美国PNAS上发表了题为“Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmid In Vitro”（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,and R.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70:3240-3244,1973）的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达,从而完善了Berg开创的基因重组技术。,25,Boyer and Cohen,26,质粒 pSC101的获得In 1972,Cohen constructed a ne

10、w plasmid beginning with DNA isolated from E.coli.Cohen named the plasmid pSC101(“SC for Stanley Cohen).The new plasmid had three important features:it had only a single recognition site where EcoRI would cut the molecule,thus identifying the spot where the plasmid would open;(2)it had a sequence of

11、 nucleotides called an origin of replication,which is needed to initiate DNA replication;such a sequence stimulates plasmids to multiply in a host organism;(3)it contained a gene for resistance to the antibiotic tetracycline;thus,bacteria having the plasmid could resist the effects of tetracycline,w

12、hereas bacteria lacking the plasmid would be killed by the tetracycline.,Cohen在重组DNA技术中杰出贡献,27,pSC101质粒DNA,28,质粒 pSC101对大肠杆菌的转化技术突破 Another key characteristic of Cohens plasmid was the ease of inserting it to a host cell.Cohen found that he could insert plasmids to fresh bacteria by suspending the l

13、atter in cold calcium chloride,then rapidly heating the bacteria to 42oC.So treated,the bacterial wall and plasma membrane open to permit the plasmids to pass through and into the cytoplasm.,Cohen在重组DNA技术中杰出贡献,29,Cohen与Boyer合作创建重组DNA分子 To some historians,the discipline of DNA technology came into be

14、ing over pastrami sandwiches at a local delicatessen in Waikiki Beach.The year was 1972.It happened that Herbert Boyer was at a scientific conference in Hawaii speaking about the EcoRl restriction enzyme.Stanley Cohen was in the audience.After the presentation,Cohen invited Boyer to lunch to explore

15、 their possible collaboration on a series of experiments.The two researchers sat and considered the experiments that would send DNA technology into a new era.,Cohen在重组DNA技术中杰出贡献,30,Cohen与Boyer合作创建重组DNA分子Cohen had been conducting fruitful experiments with plasmids,but he was experiencing difficulty c

16、utting open the plasmids.Boyers EcoRI enzyme seemed to be the ideal solution,so Cohen suggested they join forces.They would use his plasmids and Boyers enzyme to recombine the plasmid DNA.First they would try to recombine two plasmids to form a single plasmid.If successful,they would attempt to brin

17、g DNA from a foreign species into the plasmid to produce a recombinant DNA molecule.Boyer agreed,and the bargain was struck.,Cohen在重组DNA技术中杰出贡献,31,Boyer and Cohen 的策略,32,pSC102,体内构建的重组体他们首先检查了EcoR对质粒pSC101和R6-5的切割情况，发现EcoR在质粒pSC101上只有一个切点，在质粒R6-5上有12个切点,这样就可以用pSC101作为重组DNA的载体分子。,33,他们用EcoR处理过的和没有处理过

18、的 质粒pSC101和R6-5DNA分别转化E.coli C600,得到下表的实验结果 表：环状和线状质粒DNA的转化,34,他们从用EcoR处理的R6-5的卡那霉素抗性平板上选择了一个克隆，并检查了它的抗性，发现该克隆同时具有磺胺的抗性，但没有氯霉素、四环素的抗性。然后从该克隆中分离了一个环状质粒DNA，命名为pSC102，分子量大约为17106。,35,接着用EcoR分别切割pSC102 和R6-5质粒DNA，进行电泳检查，发现pSC102被切成三个片段，相对于质粒R6-5的EcoR酶切片段、和。这些结果说明不同的酶切片段转化大肠杆菌后能够在细胞内进行重组连接形成有功能的重组质粒。这一结果

19、也提示，如果能够在体外重组成功，并能将重组体引入细胞内，同样具有生物学功能。,36,pSC105，体外构建的重组体作者为了获得体外构建的重组体，分别用EcoR切割质粒pSC101 和pSC102,然后加入DNA连接酶进行连接后转化大肠杆菌，在四环素和卡那霉素双抗性的平板上检查重组情况，同时设计一些合理的对照实验。,37,表：质粒pSC101 和pSC102混合DNA的 大肠杆菌C600的转化,38,pSC101与RSF1010的共整合:pSC109的构建象pSC101一样，质粒RSF1010上也只有一个EcoR切点，所以只要用EcoR分别处理质粒RSF1010和pSC101，然后用DNA连接酶

20、将两个线性DNA连接起来转化大肠杆菌，得到一个具有三种抗性的重组质粒四环素抗性、链霉素抗性、磺胺抗性。这种重组说明两个复制子能够重组，并能在细胞内表达。,39,3.2.3 基因操作的基本过程和特点,基因操作的基本过程 涉及的过程可用分/合成、切、连、转、选、鉴六个字表示。,40,外源基因的克隆与表达,41,基因工程的技术组合,42,基因工程的特点,基因工程有两个基本的特点分子水平上的操作和细胞水平上的表达。基因工程技术的诞生使人们能够在试管里进行分子水平上的操作，象一项工程那样，进行按图施工的操作，构建在生物体内难以进行的重组体，然后将重组的遗传物质引入相应的宿主细胞，让其在宿主细胞中进行工作。这实际上是进行无性繁殖，即克隆，所以基因工程通常又称为基因克隆。,43,基因工程的基础与应用,