《基因工程制药》PPT课件.ppt

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1、,第二章 基因工程制药,主要内容：基因工程制药的基本过程。目的基因的获得及基因的表达。基因工程菌的生长代谢特点，其质粒不稳定产生的原因及提高质粒稳定性的方法。基因工程菌的培养方式，发酵工艺及培养设备。基因工程药物的分离纯化。基因工程药物的质量控制。,第一节 概 述,传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。,人体来源：人血浆中制备人血浆白蛋白；男性尿中制备尿激酶；孕妇尿中制备绒膜促性激素；人血白细胞中制备白细胞介素等。动物来源：猪胰脏中制备胰岛素；新鲜猪血中制备SOD

2、；健康猪、牛肝制备核糖核酸等。植物来源：新鲜茶叶制备SOD；麸皮中制备植物钙镁与肌醇；玉米胚芽油中制备植物不饱和脂肪酸等。,玉米胚芽,麸 皮,生物技术的核心就是基因工程，基因工程技术最成功的应用就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。,基因工程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的优势。,胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!,20世

3、纪70年代基因工程诞生最先应用在医药科学领域。1982年第一个基因工程产品-人胰岛素在美国问世。优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用。,结晶牛胰岛素：1965年9月17日，中国首次人工合成结晶牛胰岛素。这是当时人工合成的具有生物活力的最大的天然有机化合物，使中国成为第一个合成蛋白质的国家。,基因工程药物种类,基因工程技术可生产的药物和制剂包括:(1)免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体;(2)细胞因子,如各种干扰素,白细胞介素,集落刺激生长因子,表皮生长因子,凝血因子;(3)激素,如胰岛素,生长激素,心素纳;(4)酶类,如尿激酶,链激酶,葡激酶,组织型纤维蛋白溶酶原激活剂,超氧化物歧化酶

4、.,基因工程药物：采用基因工程技术研制的，能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以用传统方法制取的特殊药物。,第二节 基因工程药物生产的基本过程,基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。,基因工程基本过程,基因工程药物制药的主要程序:目的基因的克隆，构建DAN重组体，构建工程菌，目的基因的表达，表达产物的分离纯化，产品的检验等。,基因工程药物制药的主要程序,获得目的基因 组建重组质粒 构建工程菌（或细胞）培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤半成品检定 成品检定 包装,基因工程药物生

5、产的上游和下游,上游：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。,工程菌（或细胞）构建中重要的工具,该过程中重要的工具便是酶：限制性内切酶和连接酶是将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其他宿主菌（细胞）大量复制目的基因过程中的重要工具。同时为保证目的基因的正确性，对目的基因要进行限制性内切酶和核苷酸序列分析。,难点：真核生物的单拷贝基因在整个基因中很小部分；DNA很大，组建物理图谱和基因定位很难；真核生物基因含内含子是断裂基因，它在原核生物中不表达。,第三

6、节 目的基因的获得,克隆真核基因常用方法：反转录法，反转录-聚合酶链反应法，化学合成法，筛选基因和对已经发现的基因进行改造。,工程菌（或细胞）构建中重要的工具酶,大肠杆菌DNA聚合酶I：53DNA聚合酶活性。逆转录酶：转录RNA为DNA的酶。核酸酶S1：能降解单链DNA和RNA，打开cDNA双链的发卡结构。T4DNA连接酶：连接3 羟基 5磷酸游离端。末端脱氧核苷酰转移酶：催化一个单核苷酸转移到一个DNA分子的3羟基末端。,一、反转录法 反转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。cDNA:

7、真核基因经过转录后,经过剪切、拼接、修饰形成的成熟的mRNA，mRNA反转录的结果为cDNA。,cDNA克隆示意图,mRNA的纯化 mRNA的特点:3末端含有一多聚腺苷酸组成的末端。方法:亲和层析法 选材：mRNA丰富，目的基因表达活跃注意点：防止RNA酶污染 cDNA第一链的合成 一般 mRNA都带有3-polyA,所以可以用寡聚dT作为引物,在逆转录酶的催化下,开始cDNA链的合成。用放射性探针法检测。,cDNA第二链的合成 除去杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二链。cDNA的克隆 将cDNA与载体连接（质粒DNA,噬菌体DNA）,人工接头:人工合成的，连接在目的基因

8、两端的含有某些限制性酶切为点的寡核苷酸片断。将重组体导入宿主细胞 噬菌体感染大肠杆菌，质粒转化大肠杆菌。,cDNA文库的鉴定 基因文库：汇集某一基因组所有DNA序列的所有DNA群体。cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。,cDNA文库的鉴定 根据重组体的表型进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌体颜色改变法。然后再采用凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析测定等方法进行进一步筛选。,蓝白斑筛选

9、重组质粒与PCR鉴定重组质粒,目的cDNA克隆的分离和鉴定 核酸探针杂交法：用层析法纯化微量蛋白，根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的寡核苷酸探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。免疫反应鉴定法：无基因表型特征，无合适探针时使用。,分离到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定。主要是限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的转录方向、转录起始点等。,二、化学合成法 较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。原理：DNA是由3，5-磷酸二酯键连接技术：DNA自动合成仪,用化学法合

10、成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。,人工化学合成基因的限制有：不能合成太长的基因。目前 DNA 合成仪所合成的寡核苷酸片段仅为 5060 bp，因此只适用于克隆小分子肽的基因。,遗传密码的简并使选择密码子困难，用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。费用高。利用该法合成的基因有人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽及干扰素基因等。,工程菌（或细胞）构建中重要的工具酶,大肠杆菌DNA聚合酶I：53DNA聚合酶活性。逆转录酶：转录RNA为DNA的酶。核酸酶S1：能降解单链DNA和RNA，打开cDNA双链的发卡结构。T4DNA连接酶：连接3 羟基 5磷酸游离端。末端脱氧核苷酰转移酶：催化一个单核苷酸转移到一个DNA分子的3羟基末端。,