《基因工程作业》PPT课件.ppt

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1、2.5 基因工程概述,2.51基因工程成为现代生物技术的核心技术,生物技术革命已经成为21世纪初人类面临的四大问题之一,目前，世界许多国家将生物技术、信息技术和新材料技术作为三大重中之重技术，而生物技术可以分为传统生物技术、工业生物发酵技术和现代生物技术。现在人们常说的生物技术实际上就是现代生物技术。其中基因工程技术是现代生物技术的核心技术。,所谓基因工程（genetic engineering)是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入另一种生物的活性细胞内，并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和行使正常功能（称之为“表达”），从而创造出生物新品种或新物种的遗传学技术

2、。一般来说它是用生物化学的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而产生特定的基因产物。,2.52 什么是基因工程？,基因工程的核心技术是DNA重组技术,DNA重组技术,DNA重组技术，也就是基因克隆技术。即利用供体生物的遗传物质，或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物，构建转基因生物，该种生物就可以按人类事

3、先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。,2.53 基因工程的应用范围,利用计算机技术可以对推测出来的蛋白质进行高级结构的分析，可以对来自不同生物钟了的基因序列进行同源性分析,特殊DNA片段的一级结构（及它们的核苷酸序列）的测定也十分方便，由基因的核苷酸序列去推测蛋白质的氨基酸残基的序列也变得轻而易举,基因工程技术使基因或具有一些特殊功能的DNA片段的分离变得非常容易,具体应用,农业领域将有杀虫效果的基因转移到农作物中使之具有抗虫能力林业领域把抗虫基因转移到杨树松鼠等树木中，防治病虫害发生渔业畜牧业把生物激素基因转移到动物中去医学领域多肽药物的微生物方法制取,2.54 基因工程引发的,基因

4、工程引发了在社会、人类健康、经济、医学等领域的多种效应，开辟了许多新的领域。,基因或基因工程的重大事件,1860至1870年 奥地利学者孟德尔根据豌豆杂交实验提出遗传因子概念，并总结出孟德尔遗传定律。1909年 丹麦植物学家和遗传学家约翰逊首次提出“基因”这一名词，用以表达孟德尔的遗传因子概念。1928 AFleming发现青霉素 1943 青霉素大规模工业化生产 1944 O.T.Avery 等用实验证明DNA是遗传物质 1952年 A.D.Hershey和M.Chase证明T2噬菌体的遗传物质是DNA1953 JDWatson 和 FHCCrick发现DNA双螺旋结构 1957年 A.Ko

5、rnberg在E.Coli中发现DNA聚合酶11958年 M.Meselson和F.W.stahl提出DNA的半保留复制模型；Crick提出中心法则1961-1966 破译遗传密码 1970 分离出第一个类限制性内切酶 1972 DNA体外重组技术建立 1974年 实现异源真和生物基因在E.Coli中表达1975 GJFKohler和CMilstein建立杂交瘤技术 1975-1977年 快速的DNA测序技术1978 第一次生产出基因工程胰岛素,基因工程的重大事件,1980 美国最高法院裁定基因工程产品可获专利 1980 第一家生物技术类公司在NASDAQ上市 1981 第一只转基因动物(老鼠

6、)诞生 1982 DNA重组技术生产的家畜疫苗首次在欧洲上市；Sanger和同事完成lambda噬菌体的基因组全序列的测定1983 人工染色体首次成功合成 1985 基因指纹技术首次作为证据亮相法庭 1986 第一个转基因作物获批准田间试验 1986 第一个DNA重组人体疫苗(乙肝疫苗)研制成功 1988 PCR技术问世 1989 转基因抗虫棉花获批准田间试验 1990 美国批准第一个体细胞基因治疗试验 1990 人类基因组计划正式启动 1990 第一个转基因动物(鲑鱼)获批准养殖 1993 生物工程产业组织(BIO)成立 1994 转基因保鲜番茄在美国上市 1997 英国培养出第一只克隆羊“

7、多莉”1998 人体胚胎干细胞系建立 2000 人类基因组工作框架图完成 2001 重要粮食作物水稻基因图在中国完成 2003 人类基因组测序工作完成,2.55基因工程的主要内容,1）从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步 骤，分离出带有目的基因的DNA片段；2）在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并且具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子；3）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞，并与之一起增值4）从大量的细胞群体中筛选出获得重组DNA分子的受体细胞克隆；5）从筛选出的受体细胞克隆中提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；6）将目的基

8、因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类需要的物质。,基因工程如何施工,1、获取目的基因2、获取基因载体（质粒或病毒）3、重组DNA4、把重组DNA导入受体细胞进行 扩增5、筛选与培育,工程原料的获取,1，反向转录法2，从细胞基因组中直接分离3，人工合成,反向转录法,适用于分子质量较大而又不知其序列的基因，它以目的基因的没RNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的DNA片段，即cDNA，再在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA。,从细胞基因组中直接分离,第一步-组建基因文库第二步-检索,人工合成,依照某一蛋白质的氨基酸序列，即可按密码子推算出其积阴德核苷酸序

9、列，随后应用化学合成法，就可在短时间内合成目的基因,剪刀与浆糊工具酶,每一种酶都有自身特定的功能。有的像手术刀可以对DNA分子进行定向进行切割；有的像砌砖机，可以合成完整的双链DNA分子。常用的工具酶主要是：限制性核酸内切酶 DNA连接酶 末端转移酶 单链核酸酶 反转录酶等,工程运载体,载体的作用载体运载外源DNA进入受体细胞，是通过在载体自身的DNA核酸序列中插入外援DNA，再进入受体细胞内进行复制，在载体DNA复制时，外源DNA分子也获得了扩增和表达。,目前使用的载体-质粒 病毒具备共同特征,载体的共同特征,能在受体细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制；在其DNA插入外源基因后，仍然保持稳

10、定的复制状态和遗传特性；易于从宿主细胞中分离，并进行纯化；在其DNA序列中，具有适当的限制酶位点。,人类在知道有微生物以前就利用自然界无助不在的微生物酿酒制酱，自从知道了微生物以后，特别是进入20世纪后更是不断的利用可中微生物来发酵生产各种产品。,1.微生物基因工程和发酵工业,2.56 基因工程发展的现状,几种应用微生物发酵生产基因工程产品的例子,1.大肠杆菌的遗传学和生理学研究-与蛋白质分泌有关的基因已经知道有十个2.枯草杆菌具有良好的分泌性能-通过突变使蛋白酶逐个的失去活性3.酵母菌的遗传学研究-细胞中含有热源物质，在基因工程中的地位得到重视,2.动植物基因工程介绍,转基因动物接受生长激素

11、基因的小鼠；转基因家畜，家猪的基因改良；我国主要的转基因动物工作：猪与鱼。,四种类型：1）疾病型转基因动物；2）利用转基因动物制药；3）动物改良型；4）基础生物学研究。,3.转基因动植物研究,转基因动物研究可以使人类更好地对付各种疾病。在对付遗传病的战斗中，最关键的武器是掌握科学知识。科学家要最终战胜各种遗传疾病，首先必须搞清楚每种病的致病机理。利用转基因动物可以为研究遗传疾病的基因治疗打开方便之门。人类伦理道德一般不允许直接对人的受精卵进行基因操作，因而只有将处理过的体细胞移植到遗传病患者体内。但这种操作具有一定的危险性，必须首先在动物体内进行试验。所以，通过培育缺陷性状矫正的动物新品系，不

12、仅可以从根本上彻底消除动物的一些遗传性疾病，而且可以为这类疾病的基因治疗提供宝贵的经验和动物模型。迄今为止，这方面的研究已取得了不少进展。,未来的器官工厂,转基因动物不仅可以用来摸索基因疗法的经验，而且还可能为因患病而导致某个器官功能衰退的病人提供健康的器官，如心、肝、肾等。,几年前，英国剑桥的几位科学家为一只猪胚胎导入了人的基因，因而培育出了世界上首例具有人的基因的转基因猪，在世界上引起强烈反响，许多报刊都以具有人类心脏的猪为题对这头名叫阿斯特丽德（Astrid）的猪进行了报道。目前，这种转基因猪已发展到数百头。科学家的目的是希望这种转基因猪能为人类提供健康的器官。现在，他们已在进行把转基因

13、猪的器官移植到灵长目动物身上的试验，预计移入人体的试验将在本世纪末得以实施。如果这项计划能够成功的话，那么将解决人类备用器官的缺乏，使千百万名患者脱离死亡。,培育具有更优良性状的转基因动物,基于这一目的，科学家已培育出了转基因兔、鸡、羊、猪和鱼等。尽管成就不菲，但进一步的研究过程中还存在着一些障碍。例如，有些动物性状如瘦型或产奶多的控制基因不止一个。为了控制一个性状，需导入几个基因，光是寻找这些基因就是一项十分艰巨的任务。科学家正在探索之中。,培育抗病能力强的禽畜新品种,由于家禽、牲畜很容易相互传染，所以培育有抗病基因的转基因动物十分必要。导入Mxl基因而培育出来的转基因鼠能抵抗流感病毒。借助

14、于这种转基因鼠可进一步研究其它动物，但要设法控制其它一系列不良的连锁反应。由于人们对有关动物基因的基础知识了解得相对较少，所以这一目标的产品要投放市场尚需若干年的艰苦努力。,促进基础生物学研究的发展,基础科学是源，实用科学是流，只有基础科学发展了，实用科学才能得到发展，所谓源远才能流长。因此，以基础生物学研究为目的进行的转基因动物的研究万万不可忽视。请看下面这则报道MAYO诊所研究员繁殖出具有老年性痴呆病特征的小鼠：,这只小鼠模拟了人类神经纤维缠结的形成过程，为研究者希望攻克预防、治疗老年性痴呆和其他痴呆症提供了重要的基础。在Dennis Dickson博士的领导下，Michael Hutto

15、n哲学博士、Jada Lewis哲学博士、MAYO诊所的一群神经生理学家、神经遗传学家和纽约Albert Einstein大学医学院的同事们通过基因工程繁殖出控制tau蛋白产生的基因突变后的小鼠。这种突变已为人们所知，能导致额颞性痴呆的遗传。自出生六个半月后，小鼠开始产生神经纤维缠结，即异常扭曲的tau蛋白链丛，表现出与患有痴呆症病人相似的症状。,转基因植物的研究,转基因植物和转基因动物的目标都是优良品种，两者之间却有很大不同。在动物转基因工程中接受外来基因的细胞一般是受精卵，可是在植物转基因工作中接受外来基因的往往都是身体细胞。,难道人们要去治好一株什么植物的某种遗传病吗。如果不是这么一回事

16、，又是什么理由要用身体细胞来接受外来基因呢。,其实许多植物非但可以从一个枝条长成一个植株，而且可以从单个细胞或细胞集团长成植株，所以用身体细胞接受外来基因的方法可以培育转基因植物品系，由这一原理带来转基因植物工作的技术上的特点-微生物化，可以像对待微生物细胞那样对待植物细胞，可以用培养皿来培养植物细胞，可以利用抗药性来筛选接受了外来基因的细胞等等，从而大为提高工作效率。,例子 说明在转基因植物研究中的微生物化操作。,首先取烟草的身体细胞（例如叶片细胞）用分解纤维素的酶（例如蜗牛胃里的酶）处理以去除它的坚硬的细胞壁，去除了细胞壁的细胞变成圆球状的原生质体。把运载着外来基因的载体DNA去转化原生质

17、体，基因载体上有一个卡那霉素抗性基因。把转化后的原生质体培养在含有卡那霉素的固体培养基上，可以看到在大量死去的细胞的背景上有大约十几个细胞集团，这些便是由接受了基因载体的抗卡那霉素烟草细胞所长的集落，把这些集落中的细胞转移到含有卡那霉素的器皿中便会长出枝叶来，而一般的烟草细胞则由于对卡那霉素呈敏感状态所以不能在这上面长出枝叶来。,世界上许多国家都在研究转基因植物,1986年全世界获准进行田间试验的转基因植物仅5例。19861992年间增加到675例，获准转基因植物进人田间试验的国家有美国、比利时、法国、英国、西班牙、加拿大。荷兰等28个国家。就植物种类来看以马铃薯占首位（134例），依次是油菜

18、（122例）、烟草（96例）、西红柿（76例）、玉米（63例）、甜菜（34例）、棉花（30例）、大豆（27例）、甘落（23例）等。就基因种类来看以除莠剂抗性占首位（247例），依次是品质改良（116例）、抗病毒（104例）、抗虫（89例）、抗病（20例）等。1994年底全世界获准进行田间试验的转基因植物已急增到1467例。到目前为止，正式批准上市的转基因植物至少已经知道有两例：美国的延熟耐贮西红柿和法国的抗除莠剂烟草，可望更多的转基因植物即将陆续上市。,转基因植物除了用于产量提高以外，同样可应用于质量的改进。除了提高蛋白质的必需氨基酸含量以外，在改变油脂组分、延长果品的保鲜期、改变花卉的颜色等

19、等都有报道，还传说通过转基因途径育成了方形的西红柿，这种西红柿便于装箱运输。像动物那样利用转基因植物生产珍贵的蛋白质的设想未必很现实，可是培育一个高蛋白的转基因甜菜品种，把制糖的下脚作为家畜的饲料却是一种在商业上行得通的策略。看来在转基因植物领域正是人们充分发挥想象力的广阔天地。,我国在过去10年中在转基因植物方面也取得了可喜成果；获得了抗细菌病的转基因马铃薯、抗赤霉病的转基因小麦、抗小菜蛾的转基因甘蓝、抗病毒的转基因烟草等，此外在耐盐转基因植物和提高必需氨基酸含量的转基因马铃薯等方面也取得了成果。,什么是基因治疗？,基因治疗是用于人体的基因工程，是把基因导入人体的治疗方法，最初用于遗传病的治

20、疗，现在已经推广到癌症和艾滋病，也延伸到诊断标记方面。,已知有几千种疾病是单个基因发生突变的结果，癌症、艾滋病等在一定程度上也与一个基因或多个基因的突变有关。还有一些遗传病是与整个染色体额外存在有关，例如唐氏综合症患者的21号染色体不是一对而是有3个。各种遗传病的出现率大约是1：4001：100，000，把45000种遗传病加在一起的出现率就十分可观了，所以在传染病日益受到控制的时代中遗传病的问题也就日益显得重要了,不依赖于基因治疗，某些遗传病在某种程度上是可以防止出现或医治，或者减轻症状的,基因治疗研究进入到人体试验阶段以前先要经过动物试验，所以基因治疗研究也包括实验动物研究在内。为了模拟患

21、病的人，往往得在实验动物身上诱发特定的症状。人细胞和几种实验动物细胞就大差别,人和几种实验动物接受反转录病毒基因载体的效率,细胞来自 接受率小鼠 50%80%羊 2%5%狗 6%25%猴 10%25%人 1%4%,目前研究的基因治疗都以身体细胞作为接受外来基因的对象，通过治疗希望患者的疾病可以治愈或者病情可以好转，不过患者所生的子女仍然可能是同一种遗传病的患者。另一种基因治疗以受精卵为接受外来基因的对象，在理论上通过这一途径可以使患者的子孙后代免于患同一遗传病。可是由于它带来许多社会问题，所以目前这方面的研究只限于实验动物或者家畜。在以身体细胞为接受外来基因的对象的基因治疗方面存在着三种可被选

22、择的途径：原位疗法、体外疗法、体内疗法。,生物对象是不容选择的，可是接受外来基因的细胞种类却必须选择。,原位疗法指把基因导入局部组织的疗法，它不用于全身性的疾病而 适用于局部性的疾病。例如对于遗传性肌肉萎缩症患者可以把运载 着相应的野生型基因的载体注射到肌肉组织中,什么是原位疗法？,体外疗法指把基因导入离体培养的细胞中，然后再把这些细胞放回到患者体内的疗法，骨髓细胞是最常用的细胞。它适用于全身性的遗传病的治疗，例如一些免疫缺损症。体内疗法指把外来基因引入血流中，让它自己去找到需要治疗的靶细胞。,什么是体外疗法？,第一个成功的基因治疗,1990年9月14日美国的一个年仅4岁的小女孩接受了基因治疗

23、而且取得了成功。她患的是遗传性的严重复合免疫缺损症，原因是她继承了父母亲的各自的一个缺损基因。基因治疗采用的是体外疗法。从患者身上取出免疫系统中的白细胞，把野生型即正常的基因引入白细胞，然后把这些细胞注入血液中，在4个月内重复4次。患者本来总是面容憔悴而且易受感染，现在已是一个健康活泼的小姑娘了。,我国从事恶性肿瘤基因治疗研究的有上海市肿瘤研究所、中国预防医学科学院病毒学研究所、哈尔浜医科大学、上海第二医科大学、中科院上海生物化学研究所等，从事遗传病基因治疗的有中国医学科学院基础医学研究所（地中海贫血症）和复旦大学遗传学研究所（血友病B）等。血友病B基因治疗临床方案经卫生部药物评审中心的评审，

24、认为路线可行，同意扩大临床试验。血友病B又称为因子缺乏症，一般治疗采用反复输血或施用含有第九因子的血液制品。这些治疗虽能见效，但反复输血存在着感染艾滋病或肝炎的危险性。在这项研究中所用的基因载体是逆转录病毒，外来基因是由因子mRNA经反转录取得的DNA，治疗途径是体外疗法。把运载着IX因子基因的逆转录病毒导入体外培养的血友病B患者的皮肤成纤维细胞。首先在这些细胞的连续传代培养过程中进行一系列的检查，再进行动物试验，在动物试验合格的情况下进行人体注射的安全性试验，对患者进行小剂量的皮下注射。接受治疗的是兄弟两人，在随访过程中没有发现与基因治疗相关的副作用，扩大临床试验便是在上述初步治疗结果的基础上获得批准的。,