《基因定位》PPT课件.ppt

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1、基因组学 Genomics,第四章 基因定位,基因组学 Genomics,4 基因定位4.1 基因的鉴定 4.2 主基因定位 4.3 QTL定位4.4 分子标记辅助选择,基因组学 Genomics,4 Mapping of genes4.1 基因的鉴定,基因定位（Mapping of genes）是指通过遗传作图的方法，确定基因与遗传标记之间的关系。基因定位的前提，是要准确地鉴定基因。,基因组学 Genomics,4.1 基因的鉴定 4.1.1 基因的概念,基因的广义概念：基因是具有某种功能的DNA片段，包括结构基因和调控基因，即包括能转录和不能转录的具有某种功能的DNA序列，其含义非常广泛。

2、,基因组学 Genomics,4.1 基因的鉴定 4.1.1 基因的概念,分子遗传学的概念：基因是DNA的一个转录单位。转录产物RNA通过反转录可以合成cDNA，因此通常认为一个cDNA相当于一个基因。但是，目前大多数cDNA的功能尚不知道，因此这种基因是通过转录来识别的。,DNARNA,转录,基因组学 Genomics,4.1 基因的鉴定 4.1.1 基因的概念,孟德尔遗传学的概念：基因是控制某一性状的遗传因子。基因是通过表现型来识别的，即表现型是基因型控制的，通过表现型可以分析基因型。,基因组学 Genomics,4.1 基因的鉴定 4.1.1 基因的概念,主效基因和微效基因：从孟德尔遗传

3、学的基因概念来看，基因型是通过表现型来认识的，根据基因对表现型影响的大小，通常把基因划分为主效基因（major gene）和微效基因（minor gene）。,基因组学 Genomics,4.1 基因的鉴定 4.1.1 基因的概念,主效基因:又称主基因，是一类控制质量性状的基因，其性状表现为不连续的变异。微效基因:是一类控制数量性状的基因，因此通常称为数量性状座位（quantitative trait locus，QTL），其性状表现为连续的变异。,基因组学 Genomics,4.1 基因的鉴定 4.1.1 基因的概念,基因座位与等位基因：基因座位（locus）：基因在遗传图上的位置。等位基因

4、（allele）：在相同的基因座上，两种或多种变异基因之一。由两个以上等位基因组成的一组等位基因称为复等位基因（multiple alleles）。,A B C,A1 B1 C1,A2 B2 C2,基因组学 Genomics,4.1 基因的鉴定 4.1.2 遗传分析,判断某一性状是否由主基因控制和受多少对基因控制，首先需要对该性状作遗传分析。遗传分析的基本方法是：（1）选择具有相对性状的两个亲本杂交；（2）在F1中观察该性状属于完全显性，还是不完全显性；（3）在F2中分析分离群体中相对性状的分离。,基因组学 Genomics,4.1 基因的鉴定 4.1.3 等位性测定,由于有些基因已经定位，因

5、此在基因定位之前，需要做基因的等位性（allelism）测定，以明确要定位的基因尚没有定位。基因的等位性测定的基本方法是：（1）查阅有关文献，了解该性状目前的研究情况，包括该性状已发现多少个基因，哪些基因已定位等。（2）如果不知道要定位的基因与已定位的基因之间的关系，但它们的表现型相同，则存在它们是同一个基因的可能性，需要确定它们之间的关系。,基因组学 Genomics,4 Mapping of genes4.2 主基因定位,基因定位通常指的是主基因的定位。而微效基因的定位通常用专有名词QTL定位。,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.1 基因定位的原理,无论是遗传标记还是

6、基因，都在染色体上占有它们的座位，而这些座位都是DNA的一个片段，因此从座位上看，它们并没有什么区别。通过遗传图谱的构建，很多分子标记在染色体上的位置已经确定，因此只要确定基因与分子标记之间的连锁关系，就可以确定基因在染色体上的位置。,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.1 基因定位的原理,分子标记是通过它们产生的带型来识别的，而基因是通过它们产生的表现型来识别的。因此与前面讲述的遗传作图不同，基因定位既要分析分子标记的带型，又要分析基因型产生的表现型。基因定位的基本原理是通过分析分子标记与表现型之间的连锁关系，确定基因在遗传图谱中的位置。,Zhang et al.1996

7、,TAG,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.2 表型分析,作图群体的发展：作图群体是基因定位中不可缺少的试验材料。作图群体的基本要求是：（1）双亲具有相对性状的差异；（2）双亲应具有较高程度的多态性，以便找到紧密连锁的分子标记；（3）作图群体的大小应符合要求；（4）作图群体中相对性状的分离应符合孟德尔规律。,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.2 表型分析,表型测定：在基因定位中，目的基因的基因型是通过它的表现型来确定的，因此表现型测定是决定基因定位质量的关键。表型测定要求：（1）由于作图群体较大，表型分析通常在自然条件下进行，必须使作图群体生长正常，

8、并且应减少个体间的试验误差；（2）应以双亲和F1为对照，并统一标准；（3）表型测量要准确。表型在测量和辨别过程中通常容易出现误差，必须统一测量标准，并由熟练的人员操作；（4）必须采取基因专一性的检测方法，如特定的菌种、花粉育性等。,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.2 表型分析,表型数据的整理：原始的表现型数据都是通过一定的测量方法获得的，具有特定的单位，如长度、重量、百分比等。由于质量性状的特点，作图群体一般表现为不连续的分布，因此可以将作图群体分成若干个组。为了满足作图软件的需要，分别用不同的数字代表不同组的表现型，并与标记基因型的数值相一致。,基因组学 Genomi

9、cs,4.2 主基因定位 4.2.2 表型分析,表现型数字化转换的规定是：1-亲本1的纯合基因型（aa）2-杂合体（ab）3-亲本2的纯合基因型（bb）对于显性带型而言：4-非亲本1纯合基因型（ab或bb），即亲本2的表现型为显性；5-非亲本2纯合基因型（ab或aa），即亲本1的表现型为显性；0-缺资料,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.3 分子标记的分析,已定位标记的利用：通过遗传图谱的构建，很多分子标记在染色体上的位置已经确定，因此只要找到与基因连锁的分子标记，就可以确定基因在染色体上的位置。这类标记有RFLP标记和SSR标记等。已定位标记的利用，通常是从现有的遗传图

10、谱中，按一定距离均匀选取分子标记。1）亲本多态性的分析，筛选出具有多态性的分子标记；2）作图群体的标记基因型分析，找到与目的基因连锁的分子标记。,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.3 分子标记的分析,未定位标记的利用：有些分子标记是随机标记，如RAPD和AFLP标记等，这类标记通常没有确定在染色体上的位置，因此每次使用都是随机的。利用随机标记只能以随机的方式，从大量的标记中筛选出与目的基因连锁的分子标记。,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.3 分子标记的分析,混合池分析：混合池（bulk）分析是快速筛选出与目的基因连锁的分子标记的一种方法。这是Mic

11、helmore RW,etal.（1991）首创的。无论是已定位标记还是未定位标记，都要利用作图群体才能确定它们与目的基因的连锁关系，而作图群体通常都比较大，因此筛选与目的基因连锁的分子标记的工作量非常大。利用混合分析，可以大大地减少这方面的工作量。,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.3 分子标记的分析,混合池的组成：“混合池”由作图群体中具有相同相对性状个体的DNA组成。在作图群体中，通常选择具有同一相对性状的10-20个体的DNA组成一个混合池。这样，在一个作图群体中，两个相对性状各自组成一个混合池。理论上，两个不同相对性状的混合池除了目的基因的基因型不同外，其余基因

12、型是相同的。因此有些人把相对性状的两个混合池称为“近等基因池”。组成混合池的个体，应具有典型的表型。,基因组学 Genomics,R/R,r/r,R,r,P:,F2:,F1:,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.3 分子标记的分析,混合池的利用：在实际利用中，两个混合池通常与两个亲本一起做分子标记的分析。当两个亲本的带型有差异，而两个混合池的带型无差异时，表明该标记与目的基因不连锁；当两个亲本的带型有差异，而两个混合池的带型也有相应的差异时，表明该标记与目的基因可能存在连锁关系。通过混合池的利用筛选出可能与目的基因存在连锁关系的标记后，还要利用整个作图群体做连锁分析，才能确

13、定它们之间的连锁关系。,基因组学 Genomics,P1 P2 R S,分子标记与基因无连锁,分子标记与基因连锁,or,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.3 分子标记的分析,近等基因系的利用：近等基因系的建立：近等基因系的建立通常采用连续回交的方法进行。选择具有相对性状差异的两个亲本杂交，然后用带有隐性性状的亲本作轮回亲本回交。在每一分离世代对目的基因加以选择，经过回交7-8代以上，才能选育成近等基因系。近等基因系除目的性状外，其它性状应与轮回亲本相似。,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.3 分子标记的分析,近等基因系在基因定位中的利用：由于近等基因

14、系除目的基因外，其遗传背景与轮回亲本相似，利用近等基因系作基因定位确实是理想的材料。近等基因系通常用作亲本之一，用于发展作图群体。1）近等基因系的表现型不受复杂的遗传背景的干扰，其表现比较真实，能较真实地反映基因效应的大小。2）利用近等基因系和轮回亲本一起做分子标记分析，一旦筛选出多态性的分子标记，该标记就很可能与目的基因连锁，从而减少连锁标记筛选的工作量。,基因组学 Genomics,NIL,Chr.1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,水稻近等基因系的导入片段分析,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.4 遗传作图,筛选出与目的基因连锁的分子标记后，表明目

15、的基因与该标记连锁。如果所用的分子标记已定位，则基因所在的位置也已知道。如果所用的分子标记尚未定位，则基因所在的位置还不知道。在这种情况下，需要对连锁的分子标记定位。,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.4 遗传作图,连锁分析：基因定位的基本方法是确定表现型与已定位标记之间的连锁关系。把表现型和标记基因型都按统一的规定转换为数值，并把它们整合在一个数据库中，通过Mapmarker软件，可以分析它们之间的连锁关系,基因组学 Genomics,水稻抗白叶枯病基因xa-13的定位资料,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.4 遗传作图,随机标记的定位：随机标记定

16、位的策略是利用己知标记来定位未知标记。利用己知标记来定位未知标记的最佳方案是利用永久性作图群体。分析随机标记在永久性作图群体中的分离，并将数据加到永久性作图群体作图时已建立的数据库，再做遗传作图，就可以确定随机标记在遗传图谱中的位置。因此，永久性作图群体是随机标记定位的重要工具。,基因组学 Genomics,水稻DH群体构建的遗传图谱,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.4 遗传作图,精细定位（fine mapping）：在基因定位中，找到已定位的分子标记，只是完成了基因的粗定位，即只知道基因的大概位置，这对于基因定位来说是不完善的。基因精细定位，就是在基因粗定位的基础上，

17、进一步完善基因定位的工作。基因精细定位的目标，对于不同的目的有不同的要求。精细定位是基因图位克隆的基础。,基因组学 Genomics,4.2 主基因定位 4.2.4 遗传作图,The linkage map(a),physical map(b)and ORF prediction(c)of locus S-b on rice chromosome 5,李文涛等，2006，科学通报,基因组学 Genomics,4 Mapping of genes4.3 QTL定位,QTL（quantitative trait locus）称为数量性状基因座位。由于这类基因控制数量性状，并且表现为微小效应，因此难

18、以用主基因定位的方法来定位。随着分子标记技术的不断发展，QTL定位的方法也日趋成熟。,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.1 概况,生物性状的形成取决于两方面的因素，一是亲本的基因型，一是环境条件的影响。因此，表现型是基因型和环境条件共同作用的结果。P=G+E 其中，P表示表现型值，G表示基因型值，E表示环境条件引起的变异。相对来说，数量性状的表现型值中，由环境条件引起的变异更大。,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.1 概况,在传统的遗传分析中，通常是分析数量性状的表现型值中，基因型值所占的比率，以便评价数量性状遗传力的大小，或者是通过双列分析等方法，

19、估计控制数量性状的基因对数，但难以确定控制数量性状的基因所在染色体上的位置。分子标记的出现，为QTL定位提供了有力的手段。,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.2 基本方法,按采用的标记数目分类:单标记法 相邻双标记法 多标记法,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.2 基本方法,按使用的统计方法分类:方差分析法 回归分析法 最大似然分析法,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.2 基本方法,按作图所用区间数分类:零区间作图法 单区间作图法 多区间作图法,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.3 单标记方差分析法,单标记

20、方差分析法（single marker ANOVA（analysis of variance）是Thoday（1961）提出的。,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.3 单标记方差分析法,基本假定:基因型分别为M1M1Q1Q1和M2M2Q2Q2的两亲本杂交，F1的基因型为M1M2Q1Q2，F1产生4种配子M1Q1、M1Q2、M2Q1、M2Q2。其中，M1Q1和M2Q2的配子为亲本型，其频率为1/2（1-r）；M1Q2和M2Q1的配子为重组型，其频率为1/2（r）。,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.3 单标记方差分析法,M1Q1 M2Q2 M1Q2M2

21、Q1(1-r)(1-r)(r)(r)M1Q1(1-r)2(1-r)2 r(1-r)r(1-r)(1-r)M2Q2(1-r)2(1-r)2 r(1-r)r(1-r)(1-r)M1Q2r(1-r)r(1-r)r2 r2(r)M2Q1r(1-r)r(1-r)r2 r2(r),M1 Q1 M2 Q2 M1 Q1 M2 Q2 M1 Q1 M2 Q2,基因组学 Genomics,作图群体的基因型频率（pij）:,jQ1Q1 Q1Q2 Q2Q2 Mean i M1M1（1-r）2 2r（1-r）r2 m1 M1M2r（1-r）r2+（1-r）2 r（1-r）m2 M2M2r2 2r（1-r）（1-r）2 m

22、3,M1Q1 M2Q2 M1Q2M2Q1(1-r)(1-r)(r)(r)M1Q1(1-r)2(1-r)2 r(1-r)r(1-r)(1-r)M2Q2(1-r)2(1-r)2 r(1-r)r(1-r)(1-r)M1Q2r(1-r)r(1-r)r2 r2(r)M2Q1r(1-r)r(1-r)r2 r2(r),基因组学 Genomics,基因型的效应值（gj）:,效应值：-d 0 h d 基因型：Q2Q2（P2）1/2（P1+P2）Q1Q2 Q1Q1（P1）,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.3 单标记方差分析法,平均数的估算:平均数按以下公式计算：mi=pijgj 式中，pi

23、j为基因型频率，gj为基因型效应值。,基因组学 Genomics,按该公式计算，F2群体中分子标记座位上各种基因型的平均数为：m1=(1-r)2d+2r(1-r)h+r2(-d)=(1-2r)d+2r(1-r)h m2=r(1-r)d+r2+(1-r)2h+r(1-r)(-d)=r2+(1-r)2h m3=r2d+2r(1-r)h+(1-r)2(-d)=-(1-2r)d+2r(1-r)h假定:d h dh 0当r=0.5，即M与Q不连锁时，m1=1/2h m2=1/2hm3=1/2h即，mi=mk。mk为某一分子标记基因型效应值的平均数。反过来，如果mi=mk，则r=0.5，即表明M与Q不存在

24、连锁关系；如果mi mk，则r 0.5，即表明M与Q存在连锁关系。,基因组学 Genomics,标记与性状关联的检测:,4.3 QTL定位 4.3.3 单标记方差分析法,资料的整理：标记基因型 株号M1M1M1M2M2M2 1 2 3 株数（ni）n1 n2 n3 表型值（mi）m1 m2 m3,基因组学 Genomics,不同基因型的均值（mi）之间的差异来源于：（1）基因型的效应；（2）环境的影响。因此，需要对这些资料作组内观察值不等的单因素的方差分析。变异来源DF SS MS F 标记基因型间k-1 SSt MStMSt/MSe 试验误差（ni-1）SSe MSe 总计ni-1 SST

25、当FF0.05时，平均数间的差异显著，即mi mk，表明M与Q存在连锁关系。当FF0.05时，平均数间的差异不显著，即mi=mk，表明M与Q不存在连锁关系。,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.3 单标记方差分析法,重组率及遗传参数的估计:,根据上述的假定，亲本和F2的QTL基因型的效应值分别为：Q1Q1=d（P1）Q2Q2=-d（P2）m1=(1-2r)d+2r(1-r)hm2=r2+(1-r)2hm3=-(1-2r)d+2r(1-r)h建立联立方程：P1 P2=2d（1）m1 m3=2（1-2r）d（2）,基因组学 Genomics,P1 P2=2d（1）m1 m3=2

26、（1-2r）d（2）m1 m3 L=1-2r P1 P2式中，L定义为m1m3与P1P2的比值。1 m1m3 2 VL=Vm1-m3+VP1-P2（P1-P2）2（P1-P2）2,基因组学 Genomics,重组率的估算:,根据上述公式m1 m3 L=1-2r P1 P2得到:r=1/2（1-L）r为重组率的估计值；Vr=1/4 VL Vr为重组率估计值的方差。,基因组学 Genomics,加性效应值的估算:,根据（2）式 m1 m3=2（1-2r）d：m1 m3d=2（1-2r）d为基因加性效应的估计值；1Vd=Vm1-m3 4（1-2r）2Vd为基因加性效应估计值的方差。,基因组学 Gen

27、omics,显性效应值的估算:,m2-1/2（m1-m3）h=（1-2r）2h为显性效应的估计值;1 Vh=Vm2-1/2 m1-1/2 m3（1-2r）4Vh为显性效应估计值的方差。,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.4 QTL定位的新策略,QTL分析的发展方向：把复杂性状变为简单性状；把多基因分解为单基因（单一孟德尔因子）；把数量性状变成质量性状。,Q1 Q2 Q3,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.4 QTL定位的新策略,利用永久性作图群体作QTL分析的优势在于：（1）以品系为分离单元，使数量性状的测量比较准确。（2）可以在试验中设置重复，以减

28、少试验误差。（3）可以进行多点试验，以评价基因与环境的互作关系。,永久性作图群体的利用,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.4 QTL定位的新策略,AB-QTL（advanced backcross QTL）分析，即高世代回交QTL分析，是把QTL分析的世代推迟到BC2或BC3的一种QTL分析方法。这种方法能更好地鉴定和利用QTL，特别适用于从野生型等非优良材料中鉴定优良的QTL，并转移到优良的育种品系中。,AB-QTL分析,AB-QTL,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.4 QTL定位的新策略,AB-QTL分析的优点是：（1）与低世代群体，或称平衡群

29、体（F2、BC1等）相比，AB群体中个体的基因型（及表现型）与优良的亲本（轮回亲本）更加相似，使产量等数量性状的测量更加准确。（2）在远缘杂交的低世代群体中，通常会出现一些不良的性状（如不育性、落粒等），因此影响了对数量性状的测量。在AB群体的发展过程中，逐步淘汰一些来自供体的不良性状，使AB群体的数量性状表现更加正常。（3）由于AB群体中，供体的基因频率较低，因此供体基因型之间的相互作用（上位性作用）较小，因此供体中的QTL转移到受体后，其效应值变化不大。（4）再增加回交次数，可以较容易地获得近等基因系，即QTL-NIL。这些QTL-NIL可以进行重复的田间试验。（5）由于多次回交，在减数分

30、裂过程中有更多的机会发生重组，因此QTL与不良基因之间的连锁关系容易打破，可以更好地利用QTL。,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.4 QTL定位的新策略,次级作图群体是利用近等基因系（near-isogenic line，NIL）、导入系（introgression line，IL）、染色体片段代换系（chromosomal segment subsititution line，CSSL）等次级品系发展的次级作图群体。次级作图群体在QTL分析中得到广泛的利用，通常称为 QTL-NIL、IL-QTL等。,次级作图群体的利用,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位

31、4.3.4 QTL定位的新策略,基因组学 Genomics,4.3 QTL定位 4.3.4 QTL定位的新策略,（1）具有永久性群体的特点，可以反复使用，排除了环境的影响。（2）由于每个品系与轮回亲本的遗传背景十分相似，排除了遗传背景的干扰，因此QTL表型分析的结果较准确。（3）由于每个品系只带有来自供体亲本的很小部分，通常只有一个或少数几个片段，可以把控制同一数量性状的多个QTL进行分解，即把多基因分解为单一的孟德尔因子，使复杂性状简单化，因此大大地提高了QTL分析的准确度和可靠性。,利用次级作图群体的优势：,基因组学 Genomics,4 Mapping of genes4.4 分子标记辅

32、助选择,基因定位的目的是为了更好地利用基因。分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)就是利用与基因紧密连锁的分子标记，对目的基因进行辅助选择，从而实现对基因的有效利用。,基因组学 Genomics,4.4 分子标记辅助选择 4.4.1 基本的原理和条件,分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)就是利用与基因紧密连锁的分子标记，辅助选择目的基因的基因型。在分子标记辅助选择中，直接选择的是分子标记的基因型，而不是目的基因的基因型，因此利用分子标记选择目的基因的基因型，只是起辅助选择的作用。当分子标记与目的基因紧密连锁时，通

33、过选择分子标记的基因型，可以有效地选择到目的基因的基因型。但当分子标记与目的基因之间的距离较远时，通过分子标记的基因型选择目的基因的基因型的效果就变得较差。分子标记辅助选择的效果取决于连锁的紧密程度。,标记与基因的关系,基因组学 Genomics,水稻特异亲和基因S-c的分子标记辅助选择,基因组学 Genomics,4.4 分子标记辅助选择 4.4.1 基本的原理和条件,为了提高分子标记辅助选择的准确率，不但要选择与目的基因紧密连锁的分子标记，而且还要利用目的基因两侧的分子标记。假如某一分子标记与目的基因的距离为5cM，侧该标记与基因之间的重组率约为5%，意味着利用该标记选择目的基因的误差率约

34、为5%。如果某基因两侧各有一个分子标记，其距离均为5cM，侧两标记与目的基因之间同时发生交换的频率为:5%x 5%=0.025%考虑到交换之间的干扰，利用这两个标记选择基因的误差率应少于0.025%。这样的误差率是符合育种要求的。,基因组学 Genomics,基因组学 Genomics,4.4 分子标记辅助选择 4.4.1 基本的原理和条件,分子标记主要有两类，即RFLP标记和以PCR为基础的分子标记。过去用得较多的是RFLP标记，但RFLP标记在技术上比较复杂，在育种中难以利用。以PCR为基础的分子标记，如STS和SSR等，主要利用的是PCR技术，具有方法简单、时间短、费用少的优点，适合育种

35、上的要求。因此，建立以PCR为基础的分子标记辅助选择的技术体系，将使分子标记辅助选择技术得到切实可行的利用。,MAS在育种上利用的基本条件,基因组学 Genomics,4.4 分子标记辅助选择 4.4.2 以PCR为基础的MAS,目前已经定位的基因主要是利用RFLP标记进行的，许多基因虽然已经定位，但却难以在育种中利用。为了使这些基因在育种中得到利用，首先需要把RFLP标记转变为PCR标记。,RFLP标记转变为PCR标记,基因组学 Genomics,4.4 分子标记辅助选择 4.4.2 以PCR为基础的MAS,把RFLP标记转变为以PCR为基础的分子标记，就是把RFLP标记转变为序列标签位点(

36、Sequence tagged site，STS)标记。这个过程包括：（1）对RFLP标记（长度约为0.5-2.5kb）进行末端测序，测序的末端长度通常为100bp-300bp。（2）利用测序的末端序列设计PCR引物，PCR引物设计的原则与前述的相同。（3）利用上述设计的PCR引物进行PCR扩增，扩增的产物即为STS标记。STS标记与原RFLP标记具有相同的座位，其片段长度比RFLP标记的长度略短。,STS 标记,基因组学 Genomics,Forward primer5 GTCGACC TGCAGGTTTA GTCTAGACTC TAGAGGGACGTGCCATCTCT CGAGAGCGTG

37、 TGTGTGATGA AATGTTGCTTTTTGGATCTT GCTGGCTTGA TTTGGGCCTT AATCTAATGAAAAATCATCG GTTTCTTCTC TGATCGTTTT AATTTCAGGATAAGATAATG TGTGGTTTTT GTAG(600bp)TGGAAGTAGGTTGCG ATCGAACACC CAGCTCTCCT TATTCCGGCTACCTAGAACT TTGCCGGCGA GAGGACGGCA TTTATATACAATGGACTGAG CACAACCTTT ATATATACAA GTTATDAAGGTGATGTGATT TCGTCACGCA GTT

38、CAGGGGG CCGAGGTCCACAGGGGGGTG AGGTCAGCCT TGATAAACCG GAAATATT 3 CAGTCGGA ACTATTTGGC CT Reverse Primer,Terminal sequences of one strand of marker RG246(1 kb).From these sequences primers were designed for amplification of the corresponding genetic locus.The forward primer is on the sequence.The reverse

39、 primer is separately as a complementary sequence.,基因组学 Genomics,4.4 分子标记辅助选择 4.4.2 以PCR为基础的MAS,利用STS引物扩增产生的扩增片段长度多态性称为扩增子长度多态性(Amplicon length polymorphism，ALP)。与RFLP相比，ALP的频率明显降低。这里由于RFLP是在较长的DNA片段中产生的，其片段长度通常为2.0-20kb，而扩增子的长度较短，通常只有0.5-2.5kb。由于RFLP转变为STS后，其ALP的频率明显降低，使RFLP资料的利用出现了新的问题。,基因组学 Genom

40、ics,4.4 分子标记辅助选择 4.4.2 以PCR为基础的MAS,PBR（PCR-based RFLP）或称 CAPS（cleaved amplified polymorphic sequence）是对扩增片段再进行限制性片段分析的方法。,PBR：,基因组学 Genomics,PCR products of the waxy locus before digestion(A)and after digestion(B)with enzyme TaqI.The undigested products were separated in a 2%agarose gel and digested

41、 products were separated in a 8%polyacrylamide gel.,A,B,基因组学 Genomics,Comparison between ALP(A)and PCR-based RFLP(B)at locus RG13.The PCR products in B were digested with restriction enzymes HaeIII.,A,B,基因组学 Genomics,Amplification of Locus A PCR product No amplification-null allele-poor PCR Same siz

42、e band Different size band Digest with REn=Amplification Length Polymorphism(ALP)Restriction Digest Same size band Different size band Digest with REn=+1=RFLP Restriction Digest Same size band Different size bandDigest with=RFLP REn=+2,基因组学 Genomics,Restriction endonuclease At least oneLocus Hae III

43、 Mbo I Alu I Rsa I Taq I Hpa II RFLP detectedRG140-nd-+-nd YesRG146-NoRG170 nd-nd nd-nd NoRG173 nd+-nd nd YesRG229-+-nd+Yes RG246+-nd YesRG345-+-nd-Yes,Ability of 6 four-base recognizing restriction endonucleases to generate restriction fragment length polymorphisms from the amplicons derived from i

44、ndica and japonica rices.,基因组学 Genomics,Number of polymorphic lociChromosome Number of loci O.sativa/Indica/O.longistaminataJaponica 1 36 12 5 2 23 7 2 3 23 10 3 4 14 5 3 5 11 4 1 6 16 3 0 7 0 0 0 8 2 1 1 9 6 2 1 10 1 0 0 11 2 0 0 12 5 4 1 Total139 48/139=35%18/139=13%,Frequency of amplicon lenth po

45、lymorphisms at sequence-tagged sites of rice,基因组学 Genomics,4.4 分子标记辅助选择 4.4.2 以PCR为基础的MAS,随机的PCR标记转变为特异的PCR标记:（1）随机的PCR标记，RAPD、AFLP等；（2）随机PCR标记的克隆和测序；（3）SCAR标记 利用测序的资料设计引物，把随机的PCR标记转变为特异的PCR标记。这种标记称为序列特征扩增区（sequence characterized amplified region，SCAR）标记。,基因组学 Genomics,4.4 分子标记辅助选择 4.4.3 基因定位与MAS一体化

46、,利用微卫星标记等PCR标记进行基因定位，基因定位后直接用于分子标记辅助选择，实现基因定位与分子标记辅助选择的一体化。,利用PCR标记进行基因定位:,基因组学 Genomics,基于RFLP标记的基因定位,基于微卫星标记的基因定位,基因组学 Genomics,4.4 分子标记辅助选择 4.4.4 基因聚合,基因聚合是把多个有利基因聚合在一起的育种方法。,基因组学 Genomics,4.4 分子标记辅助选择 4.4.4 基因聚合,把控制同一性状的多个基因聚合在一起，使某一性状表现更加突出。例如，把多个水稻抗白叶枯病基因聚合在一起，培育出具有高抗、广谱抗性和持续抗性的水稻新品种。,单性状多个基因的聚合：,基因组学 Genomics,4.4 分子标记辅助选择 4.4.4 基因聚合,多个性状基因的聚合：,把控制不同性状的多个基因聚合在一起，使新品种具有多个优良性状。例如，把水稻抗白叶枯病基因与抗稻瘿蚊基因聚合在一起，培育出既抗白叶枯病、又抗稻瘿蚊的水稻新品种。,基因组学 Genomics,WxGm-6Rf-3、Rf-4S-b、S-c、S-d、S-eXa-4、xa-5、xa-13、Xa-21,直锭淀粉含量基因抗稻瘿蚊基因恢复基因亲和性基因抗白叶枯病基因,水稻重要基因的聚合育种,基因组学 Genomics,完,下一章 物理作图,